胀气食醋中污染微生物的分离鉴定、脉冲强光杀菌技术及其机理研究

摘要

我国食醋生产多以开放式的固态发酵为主，多种微生物混合发酵赋予了食醋独特的风味，但微生物污染也成为了食醋生产企业面临的主要问题。微生物污染会造成食醋产气、返混、产生异味等问题，严重影响了食醋品质及生产企业的效益。传统的热杀菌可以降低食醋微生物污染，但同时会对食醋品质造成一定的影响。因此如何达到较好的杀菌效果、同时保证食醋的品质成为了食醋生产研究领域的重要研究内容。非热物理杀菌可以有效的减少热杀菌带来的品质降低问题。本论文对胀气食醋的污染菌进行分离鉴定，以胀气食醋分离菌为研究对象，研究了脉冲强光技术对分离菌的杀菌效果，并分别进行了细胞形态、细胞通透性和蛋白质组学的研究，初步探讨脉冲强光技术的杀菌机理。 本文的主要研究内容及结果如下： （1）分析了正常食醋与胀气食醋样品的理化性质，结果发现，胀气食醋中总固形物含量约为正常组的1.6倍，总酸为正常组的1.5倍，可溶性无盐固形物、氨基酸态氮、各有机酸含量明显升高，且胀气组食醋颜色深于正常组、沉淀含量高于正常组，胀气组 CO2浓度高于 11000 ppm，远远大于空气中二氧化碳浓度。 通过分离纯化，从胀气食醋中分离得到了 6 株污染菌，发现均具有一定的耐热、耐酸和产生沉淀的能力，但其中仅有分离菌 4 号有产气能力，是导致食醋发生胀气的主要污染微生物。 对分离得到的菌进行 16S rDNA 序列测定，对比其它菌株序列，构建了系统发育树。6 株污染菌经鉴定分别为：分离菌 1 号、RT1 为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），4 号菌为特基拉芽孢杆菌（Bacillus tequilensis），RT2 为腐生葡萄球菌（ Staphylococcus saprophyticus ）， RT3 为头状葡萄球菌（Staphylococcus capitis），RT4为枯草芽孢杆菌（Bacillus stubtilis）。 （2）以致死率为主要评价指标，研究了脉冲强光对胀气食醋分离到的 4号菌的杀菌作用。脉冲强光杀菌结果表明：影响胀气食醋分离菌致死率的主要因素是闪照次数、闪照能量及菌液厚度，对杀菌参数进行优化后得到以下条件：当闪照次数为3次、闪照能量为300 J、菌液厚度为2 mm时，杀菌效果最优，分离菌致死率达到99.98%。 （3）研究了脉冲强光杀菌处理对胀气食醋分离菌 4号细胞形态、细胞膜通透性及胞内钙离子浓度的影响。扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）结果显示，经过脉冲强光处理之后，分离菌出现细胞皱缩、破损、表面穿孔、内容物外泄等现象。细胞膜通透性研究表明，胞外核酸和蛋白质的渗出浓度随着脉冲次数的增加而提高，与杀菌致死率呈正比关系，且蛋白的提高率高于核酸的提高率。 Fluo-4/AM 荧光探针法研究胞内钙离子浓度变化的结果表明，经过不同闪照次数的脉冲强光处理，分离菌胞内荧光强度显著上升，最后趋于平缓，这与胀气食醋分离菌致死率曲线一致。激光共聚焦显微镜（LSCM）观察发现，处理组整个菌体荧光呈现高亮状态，通过荧光可以分辨细菌形态；而未处理组显示出较弱的荧光强度，且分离菌菌体只有局部发出荧光。因荧光强度与胞内钙离子浓度呈正比，说明脉冲强光处理胀气食醋分离菌可增强其胞内钙离子浓度。 （4）基于串联质谱标签技术（TMT，Tandem mass tag）分析脉冲强光处理对胀气食醋分离菌蛋白质组的影响，鉴定筛选共得到可信蛋白 1551个，处理组与未处理组的差异蛋白总数为104个，其中上调蛋白数有46个，下调蛋白数有58个。经过差异蛋白的GO功能和KEGG通路分析发现，脉冲强光处理会造成与膜系统相关的蛋白发生变化，使得分离菌膜系统遭到破坏，胞内物质受到影响；其次脉冲强光处理会造成分离菌新陈代谢机能发生障碍，影响胞内关键物质代谢和能量代谢通路；细胞核物质受到破坏，造成细菌遗传性出现问题，这些可能是造成细菌死亡的重要原因。

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