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水体中微囊藻毒素的高灵敏快速免疫检测技术的研究

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论文说明:主要缩略词

声明

第一章绪论

1.1藻毒素的产生和理化性质

1.1.1藻毒素的产生及生成途径

1.1.2 MCYSTs的种类、结构和理化特性

1.2 MCYSTs与生物安全

1.2.1 MCYSTs的危害和毒性机理

1.2.2 MCYSTs在生物链中的分布

1.2.3藻毒素的污染现状

1.3国内外微囊藻毒素的分析方法进展

1.3.1生物分析法

1.3.2色谱分析法

1.3.3免疫化学方法

1.3.4时间分辨荧光免疫分析法

1.3.5其他仪器分析法

1.3.6不同分析方法的比较

1.4酶免疫测定法(Enzyme immunoassay,EIA)

1.4.1 ELISA技术的基本原理

1.4.2 ELISA技术的优缺点

1.5胶体金免疫检测技术的研究进展

1.5.1胶体金免疫检测技术的兴起

1.5.2胶体金免疫检测技术的原理和特点

1.5.3胶体金免疫检测技术的分类和应用

1.6立题的目的意义和主要研究内容

1.6.1立题的目的意义

1.6.2论文的研究目标、主要研究内容

参考文献

第二章MC-LR人工抗原和检测抗原的制备及鉴定

2.1引言

2.1.1抗原制备原理及方法

2.1.2本章研究目的和主要研究内容

2.2材料与设备

2.2.1材料

2.2.2设备

2.3实验方法

2.3.1合成方法

2.3.2鉴定

2.4结果与讨论

2.4.1 MC-LR标准溶液最大吸收波长(λmax)结果及标准曲线线性范围

2.4.2偶联物的柱分离

2.4.3 MC-LR,KLH(BSA)及偶联物的紫外光谱扫描图

2.4.4偶联物结合比

2.4.5抗血清效价测定结果

2.4.6 讨论

2.5本章小结

参考文献

第三章抗微囊藻毒素抗体的制备与鉴定

3.1引言

3.1.1抗体的定义

3.1.2多克隆抗体的制备

3.1.3单克隆抗体的制备

3.1.5本章主要研究内容

3.2主要材料和设备

3.2.1主要材料

3.2.2设备

3.3实验方法

3.3.1多抗

3.3.2单抗的制备

3.3.3单抗的鉴定

3.4结果与讨论

3.4.1抗血清(多抗)的效价

3.4.2抗血清(多抗)的抑制浓度IC50、灵敏度和交叉反应率

3.4.3亲和常数的计算

3.4.4 Balb/C小鼠对MC-LR-KLH的免疫应答

3.4.5细胞融合及阳性克隆的筛选

3.4.6单抗鉴定结果

3.5本章小结

参考文献

第四章抗MC-LR单克隆抗体胶体金结合物的制备及鉴定

4.1引言

4.2本章研究目的和主要研究内容

4.2.1研究目的

4.2.2主要研究内容

4.3材料与设备

4.3.1材料

4.3.2实验仪器

4.4方法

4.4.1胶体金的制备

4.4.2单克隆抗体预处理

4.4.3最适抗体稳定量的确定

4.4.4单克隆抗体胶体金结合物的制备及纯化

4.4.5 CG-MoAb免疫反应性鉴定

4.4.6可见光光谱扫描分析

4.4.7圆二色谱分析

4.4.8红外光谱分析

4.4.9荧光光谱分析

4.5结果与分析

4.5.1胶体金的合成原理

4.5.2胶体金合成条件的优化

4.5.3最适抗体稳定量

4.5.4免疫反应性鉴定

4.5.5可见光光谱扫描鉴定

4.5.6圆二色谱分析

4.5.7红外光谱分析

4.5.8荧光光谱分析

4.6本章小结

参考文献

第五章MC-LR胶体金免疫层析检测技术的建立

5.1引言

5.1.1胶体金免疫层析检测技术概述

5.1.2建立MC-LR胶体金免疫层析快速检测方法的必要性

5.2本章主要研究内容

5.3材料与设备

5.3.1材料

5.3.2设备

5.4实验方法

5.4.1 MC-BSA包被浓度的确定

5.4.2 CG-MoAb稀释度的确定

5.4.3试纸条辅材的确定

5.4.4最低检出限

5.4.5重现性

5.4.6特异性

5.4.7检测时间

5.4.8 CGICT检测水样误差分析

5.5结果与分析

5.5.1 MC-BSA和羊抗鼠IgG包被浓度的确定

5.5.2胶体金-抗MC-LR单克隆抗体结合物稀释度的确定

5.5.3试纸条辅材的确定

5.5.4最低检出限

5.5.5重现性

5.5.6交叉反应率

5.5.7检测时间

5.5.8误差分析

5.6本章小结

参考文献:

第六章MC-LR高灵敏ELISA检测方法的建立

6.1引言

6.2本章研究目的和主要研究内容

6.2.1研究目的

6.2.2主要研究内容

6.3材料与设备

6.3.1材料

6.3.2设备

6.3.3水样采集

6.4方法

6.4.1间接竞争ELISA测定方法(icELISA)

6.4.2抗藻毒素MC-LR多克隆抗体与包被抗原最佳工作浓度的确定

6.4.3抗原-抗体反应状态对反应时间的影响

6.4.4标准曲线的拟合

6.4.5方法的灵敏度和特异性

6.4.6重现性

6.4.7 ELISA检测水样误差分析

6.5结果与分析

6.5.1多克隆抗体与包被抗原MC-LR最佳工作浓度的确定

6.5.2振荡对反应时间的影响

6.5.3 icELISA标准曲线的建立

6.5.4 icELISA的灵敏度和特异性

6.5.5方法重现性

6.5.6误差分析

6.6本章小结

参考文献

第七章微囊藻毒素-LR酶免试剂盒、“金标”试纸条的研制及验证

7.1引言

7.2本章主要研究内容

7.3材料与设备

7.3.1材料

7.3.2设备

7.4实验方法

7.4.1 MC-LR酶免试剂盒的组成

7.4.2 MC-LR酶免试剂盒的组装工艺

7.4.3试剂盒重要技术指标确定确定及稳定性试验

7.4.4 MC-LR酶免试剂盒的操作步骤

7.4.5 MC-LR“金标”试纸条的组成

7.4.6 MC-LR“金标”试纸条的组装工艺

7.4.7试纸条重要技术指标的确定及回收率、稳定性试验

7.4.8 MC-LR“金标”试纸条检测操作步骤

7.4.9 HPLC法检测步骤

7.5结果与讨论

7.5.1 MC-LR酶免试剂盒稳定性试验结果

7.5.2 MC-LR酶免试剂盒回收率

7.5.3 MC-LR酶免试剂盒重要技术指标

7.5.4 MC-LR酶免试剂盒与同类产品的验证

7.5.5 MC-LR“金标”试纸条稳定性试验结果

7.5.6 MC-LR“金标”试纸条回收率实验结果

7.5.7 MC-LR“金标”试纸条重要技术指标

7.5.8两种产品与HPLC法的验证结果

7.6讨论

7.7本章小结

参考文献

总结与展望

主要创新点

攻读博士学位期间承担的相关课题及申报专利

攻读博士学位期间发表的相关论文一览表

致谢

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摘要

采用胶体金免疫层析技术(CGICA)和酶联免疫吸附技术(ELISA),建立了微囊藻毒素(MC-LR)的高灵敏快速检测方法,并研制出具有我国自主知识产权的高灵敏度酶免检测试剂盒和快速“金标”检测试纸条。 在研究中采用“活泼酯法”和“碳二亚胺法”,分别制备了MC-LR-KLH免疫抗原和MC-LR-BSA检测抗原。按常规方法免疫新西兰大白兔20周,经采血,饱和硫酸胺沉淀纯化得到抗MC-LR的多克隆抗体。同时,免疫Balb/c小鼠,用细胞融合和杂交瘤技术筛选,获得了高特异分泌抗MC-LR单克隆细胞株,经小鼠体内扩大培养,纯化后获得抗MC-LR的单克隆抗体。利用制备的多克隆抗体, MC-LR-BSA检测抗原,以及相应的ELISA常规试剂,建立了MC-LR的间接竞争ELISA方法,对方法的灵敏度,线性范围,特异性,重现性,误差影响因素等主要技术指标进行了考核,同时研制出了相应的检测试剂盒,考核其稳定性和回收率,并与相关的其他检测方法及国内外同类试剂盒进行了比对验证。利用制备的抗MC-LR单克隆抗体,MC-LR-BSA检测抗原以及相应的CGICT常规试剂和辅材,建立了。MC-LR的胶体金免疫层析快速检测方法,对方法的灵敏度,特异性,重现性,检测时间,误差影响因素等主要技术指标进行了考核,同时研制出了相应的“金标”快速检测试纸条,考核其稳定性和回收率。用HPLC法对其进行了比对验证。 利用多克隆抗体建立的MC-LR间接竞争ELlSA法和研制的酶免检测试剂盒,其灵敏度为0.05μg/L,检测线范围为0.1μg/L~10μg/L,拟合线性方程为Y=-202355x-0.4119,相关系数R<'2>=0.9987, IC<,50>为0.65μg/L,与MC-RR交叉反应率<30%,与MC-LW,MC-LF的交叉反应率均<1%,重现性为0.86~7.21%,平均3.96%,检测时间<2.5h,有效期大于6个月,样品检测回收率为79.8~117.8%,平均为93.25%,与进口和国内同类试剂盒的比对实验结果,P>0.05,无明显差异,与HPLC方法比对,结果经CHITEST检验,为0.9996,具有良好的相关性。 利用单抗建立的MC-LR胶体金免疫层析检测技术及“金标”快速检测试纸条,最低检出限为10μg/L,重现性非常好,与MC-LF,MC-LW交叉反应率均<1%,与MC-RR的交叉反应率<20%,试纸条检测时间<10min,有效期>10个月,样品检测回收率为76.9-83.3%,与HPLC方法进行阴性阳性样品检测结果比对,总符合率为95%。

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