IL2-HSA融合蛋白ELISA检测方法的建立与初步应用

摘要

白细胞介素-2(Interleukin-2，IL-2)是一种由激活的T细胞产生的细胞因子，通过促进辅助性T淋巴细胞以及细胞毒性T淋巴细胞的增殖，增强人体的免疫能力，现已经成为临床治疗肿瘤和自身免疫性疾病的一种引人注目的生物制剂。为提高IL-2在体内的半衰期，实验室构建了携带有IL2-HSA融合蛋白编码基因的质粒pPIH，并在Pichiapastoris GS115中成功表达。该方法增大了蛋白药物的分子量，降低了异源蛋白的免疫原性，从而可以减少肾小球滤过率和体内清除率，有效提高IL-2在体内的半衰期，具有非常广阔的生产以及临床应用前景。在即将进行的药代动力学研究和后期临床应用中迫切需要一种能够定量检测IL2-HSA融合蛋白的方法。本课题旨在建立一种双抗体夹心ELISA方法，可以定量检测完整的IL2-HSA融合蛋白。
　　 首先从已经构建好的IL2-HSA表达菌株Pichiapastoris GS115出发，经发酵培养、蛋白纯化得到纯度较高的IL2-HSA融合蛋白，作为抗原标准品。经过蛋白定量分析，抗原标准品含量为80μg/mL；WestenBlot分析表明，该融合蛋白同时具有IL-2和HSA的免疫原性；利用IL-2依赖细胞株CTLL-2，采用MTT法测定融合蛋白标准品的比活性为1.393×107IU/mg。然后选取两株针对IL2-HSA融合蛋白两端多肽的抗体，建立了双抗体夹心ELISA定量检测IL2-HSA融合蛋白原型药物的方法。该检测方法的灵敏度达到10.25ng/mL，线性检测范围19.53ng/mL～1250ng/mL，相关系数r2>0.988。经方法学考核，批内、批间变异系数分别为6.19%和8.10%，发酵液上清回收率为98.13%～102.94%，与IL-2、HSA基本无交叉反应，健全性分析表明发酵液及小鼠血清稀释倍数对该方法无影响，稳定性试验显示预包被酶标板可在4℃下稳定存在3个月以上。将该方法用于发酵和纯化过程中的融合蛋白的检测，可以有效检测目的蛋白的含量，为发酵和纯化工艺的优化提供了必要的数据支持，并为后期药代动力学以及临床研究提供了备选分析方法。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 绪论

1.1 概述

1.2 IL2-HSA融合蛋白简介

1.2.1 人白介素-2

1.2.2 IL-2的生物学作用及临床应用

1.2.3 长效多肽药物的研究

1.2.4 IL2-HSA融合蛋白

1.3 蛋白多肽药物的分析方法

1.3.1 蛋白多肽类药物研究现状

1.3.2 蛋白质多肽药物分析方法

1.3.3 定量分析方法的方法学验证

1.4 酶联免疫分析方法

1.4.1 基本原理

1.4.2 基本类型

1.4.3 ELISA的应用

1.5 立题背景及研究内容

1.5.1 立题背景和目的

1.5.2 研究内容

第二章 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 主要仪器及试剂

2.1.2 菌株、细胞株及试验动物

2.1.3 融合蛋白表达使用培养基

2.1.4 融合蛋白活性测定使用培养基：

2.1.5 缓冲液及试剂配制

2.2 方法

2.2.1 P.pastoris GS115/pPIH的发酵培养与诱导表达

2.2.2 IL2-HSA融合蛋白的分离纯化

2.2.3 蛋白质样品的SDS-PAGE分析

2.2.4 IL2-HSA融合蛋白的Western blot鉴定分析

2.2.5 蛋白质样品的定量分析

2.2.6 融合蛋白IL2-HSA活性分析

2.2.7 双抗体夹心ELISA步骤

2.2.8 双抗体夹心ELISA实验条件的选择与优化

2.2.9 双抗体夹心ELISA检测IL2-HSA融合蛋白标准曲线的制作

2.2.10 双抗体夹心ELISA检测IL2-HSA融合蛋白分析方法的考核

2.2.11 IL2-HSA融合蛋白的双抗体夹心ELISA初步应用

第三章 结果与讨论

3.1 纯化融合蛋白鉴定与纯度分析

3.2 纯化融合蛋白细胞活性测定结果

3.3 标准参考品中IL2-HSA融合蛋白浓度的定量分析

3.4 双抗体夹心ELISA反应试验条件的选择与优化

3.4.1 ELISA固相载体的选择

3.4.2 酶标板均一性考察

3.4.3 包被抗体和酶标抗体的配对实验

3.4.4 包被抗体和酶标抗体工作浓度的选择

3.4.5 包被缓冲液及其pH和盐离子浓度对包被效果的影响

3.4.6 包被温度及时间的选择

3.4.6 封闭剂的选择与优化

3.4.7 洗板条件的选择

3.4.8 标准曲线的制作

3.5 双抗体夹心ELISA方法学考核

3.5.1 灵敏度

3.5.2 精密度

3.5.3 稳定性

3.5.4 特异性

3.5.5 回收率

3.5.6 健全性分析

3.6 ELISA检测方法的初步应用

3.6.1 发酵过程中融合蛋白的检测

3.6.2 纯化过程中融合蛋白的检测

3.6.3 小鼠血清中融合蛋白的检测

结论与展望

主要结论

展望

致 谢

参考文献

附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文