胃泌素/CCK2R通过JAK2/STAT3通路上调COX-2表达诱导胃癌细胞增殖

摘要

背景:胃癌在世界癌症死亡中位居前列，在发展中国家包括我国，新发和死亡病例高达70％以上。流行病学统计表明，幽门螺杆菌感染在胃癌的发病中起着重要作用。幽门螺杆菌感染可使胃泌素分泌增多，同时使环氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）表达持续增高，促进胃癌的发生发展，并起着重要的作用。胃泌素是一种重要的胃肠激素，它主要是由胃窦的G细胞分泌，它主要的生理作用是促进胃黏膜分泌胃酸以及营养胃黏膜细胞。近年来研究发现，在消化系肿瘤的发生发展中，胃泌素起着重要的促进作用。我们前期研究提示:COX-2有可能为胃泌素的下游靶标之一，但是胃泌素如何调控COX-2的表达目前尚未完全明确阐明，探索胃癌细胞COX-2表达被胃泌素调控的具体分子机制，可以建立有效分子阻断策略，为临床防治胃癌提供新的潜在药物靶点和理论依据。
　　目的:研究胃泌素如何调节胃癌细胞COX-2基因，胃泌素对胃癌细胞增殖的影响，探讨有关信号转导通路和分子，进一步阐明胃泌素调控COX-2表达分子机制。
　　方法:
　　1.研究对象:选取两株不同分化程度、CCK2R高表达的胃癌细胞株SGC-7901与MKN-45。
　　2.RNA干涉:设计、合成特异性小干涉RNA，针对目的基因，瞬时转染胃癌细胞，使目的基因表达下调。
　　3.过表达质粒的构建和转染:设计、合成全长cDNA片段过表达质粒，使其包含目的基因，瞬时转染胃癌细胞，进一步使目的基因表达上调。
　　4.实时荧光定量多聚酶链反应(qRT-PCR):收集转染后或者过表达质粒的胃癌细胞，抽提总RNA并逆转录，qRT-PCR检测目的基因mRNA表达水平，以GAPDH表达作为参照，评价干涉及过表达效率。
　　5.免疫印迹法:检测转染后目的基因蛋白表达水平，检测胃泌素调控胃癌细胞COX-2表达作用以及有关信号通路和信号分子活化水平。
　　6.信号通路抑制实验:使用不同的信号通路抑制剂，检测相关蛋白的表达水平。
　　7.抑制细胞增殖实验:MTT法检测在不同处理作用下，胃癌细胞的增殖水平。
　　结果:
　　1.胃泌素能诱导胃癌细胞COX-2的表达，这种表达呈浓度与时间依赖性。
　　2.CCK2R介导胃泌素诱导的胃癌细胞COX-2表达。阻断胃泌素/CCK2R结合或者下调CCK2R表达都能抑制胃泌素诱导COX-2表达，而CCK2R过表达后，胃泌素所诱导的COX-2表达进一步升高。
　　3.通过CCK2R介导，胃泌素激活JAK2/STAT3信号通路。
　　4.JAK2/STAT3信号通路参与了胃泌素/CCK2R调控胃癌细胞COX-2表达，而抑制JAK2/STAT3信号通路磷酸化水平，同时也抑制胃泌素诱导的COX-2表达。
　　5.胃泌素/CCK2R促进胃癌细胞的增殖，这种增殖呈浓度与时间依赖性。而CCK2R特异性拮抗剂可以抑制这种增殖;同时，AG490（特异性JAK2抑制剂）、NS-398（选择性COX-2抑制剂）都能抑制这种增殖作用。另外，干涉CCK2R能阻断这种增殖，而CCK2R过表达后，这种增殖水平进一步增高。
　　结论:胃泌素通过CCK2R介导激活JAK2/STAT3信号转导通路上调COX-2的表达调控了胃癌细胞增殖。

目录

声明

摘要

1．引言

2．材料和方法

2．1 材料

2．2 实验方法

3．结果

3．1 胃泌素浓度依赖性地刺激胃癌细胞，使COX-2蛋白表达增加

3．2 胃泌素时间依赖性地使胃癌细胞COX-2蛋白表达增加

3．3 胃泌素作用于胃癌细胞使COX-2蛋白表达上调，这种效应可以被特异性CCK2R拮抗剂YM022抑制

3．4 干涉胃癌细胞使其CCK2R表达下降后，可以使胃泌素引起的COX-2蛋白表达升高受到抑制

3．5 质粒转染使胃癌细胞CCK2R表达匕调，可以使胃泌素引起的COX-2蛋白表达进一步增加

3．6 进一步观察胃泌素/CCK2R对胃癌细胞STAT3磷酸化水平的影响

3．7 胃泌素使P-STAT3表达升高，这种作用是浓度依赖性的

3．8 特异性CCK2R拮抗剂YM022能阻断胃泌素上调STAT3磷酸化水平

3．9 通过基因沉默使CCK2R表达下调后，则胃泌素引起的p-STAT3表达升高受到抑制

3．10 转染使CCK2R过表达后，可以使胃泌素诱导的p-STAT3水平进一步上调

3．11 AG490(特异性JAK2信号通路的抑制剂)可以抑制p-STAT3蛋白水平，并使胃泌素引起的COX-2表达升高受到抑制

3．12 通过基因手段使STAT3蛋白表达下降后，胃泌素诱导的COX-2蛋白的表达也下降

3．13 胃泌素能促进胃癌细胞生长，这种作用是浓度依赖性的

3．14 用抑制剂或拮抗剂预先作用于细胞后，观察胃泌素对胃癌细胞生长水平的影响

3．15 通过基因手段使CCK2R表达下调后，可以使胃泌素引起的胃癌细胞生长受到抑制

3．16 使CCK2R表达升高后，胃泌素诱导的胃癌细胞生长被进一步促进

3．17 通过基因手段干涉使STAT3表达下降后，可以抑制胃泌素引起的胃癌细胞生长

4．讨论

参考文献

全文总结

综述

附录

攻读学位期间发表文章情况

致谢