s-lap与凋亡相关性的研究及其多克隆抗体的制备

摘要

s-lap是本实验室利用mRNA差异显示技术在可见光诱导的凋亡早期的猪视网膜色素上皮(RPE)细胞中克隆的一个新的基因，GenBank登录号为AF509472。s-lap基因具有一个开放阅读框架，可编码101个氨基酸。因为s-lap基因的mRNA只表达在可见光损伤的RPE细胞，而在正常的RPE细胞中则不表达，因此我们推测该基因与可见光所致的RPE细胞损伤具有密切关系，但对s-lap的作用及机制尚不清楚。 本研究首先构建了pcDNA3.1/s-lap/GFP真核表达载体，并通过转染四种哺乳动物细胞来观察s-lap蛋白的细胞内定位，结果表明s-lap蛋白分布在整个细胞，但以细胞核表达为主，提示s-lap可能在细胞核内发挥作用。 因为s-lap是在光损伤的凋亡早期的RPE细胞中表达的一个基因，所以我们进一步对s-lap的超表达与细胞凋亡之间的相关性进行了研究。虽然基因组电泳结果显示在超表达s-lap基因的293T细胞中没有出现标志细胞凋亡的DNA梯状带，但超表达s-lap基因后的细胞周期检测结果却表明，s-lap/GFP融合蛋白可使293T细胞周期发生明显的改变，可使G2/M期明显阻滞。推测s-lap基因可能通过影响细胞周期来参与细胞凋亡的过程。 为了进一步研究s-lap蛋白的组织分布及其功能，制备抗s-lap抗体是十分重要的。因此我们构建了pET-28a(+)/s-lap原核表达载体，并在大肠杆菌BL21中通过IPTG诱导表达，然后利用Ni2+柱进行亲和层析对重组蛋白进行纯化。用纯化的带组氨酸标签的s-lap蛋白免疫BALB/c小鼠，制备了抗s-lap蛋白的多克隆抗体，并通过免疫印迹检测了此多克隆抗体的特异性，结果表明，抗s-lap抗体(1：400稀释)可以和s-lap蛋白特异性结合。此抗体的制备为进一步研究s-lap基因与凋亡发生的相关性及其机制奠定了坚实的物质基础。

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