油茶PHT1基因的克隆与功能表达研究

摘要

油茶(Camellia oleifera)是中国南方重要的木本食用油料树种。目前全国油茶栽培面积达366.6万hm2，年产油茶近45万t，平均产茶油仅45～90 kg/hm2。油茶主要分布在南方酸性红壤地区，磷缺乏是油茶增产的主要限制因子。磷吸收是跨表皮及皮层细胞质膜的逆浓度主动运输过程，而该过程主要依靠根系细胞膜上PHT1基因家族高亲和力磷转运子调节。因此研究油茶PHT1基因对探索油茶磷胁迫分子响应机制以及提高磷利用效率具有重要意义。本研究主要在油茶磷酸转运子PHT1基因的分离克隆以及其在油茶组织和转基因烟草中的表达等方面开展研究，主要的研究结果如下: 1.油茶PHT1基因的cDNA克隆、基因组克隆及生物信息学分析。以油茶国家审定品种‘华硕’为材料，采用RT-PCR和RACE等技术克隆出油茶磷酸转运子PHT1基因家族一个成员的全长cDNA序列，命名为CoPht1（GenBank登录号:JX403969）。油茶高亲和力磷转运基因CoPht1的开放阅读框长度为1626 bp，编码541个氨基酸，所形成的蛋白分子量为59.64KD，等电点为8.67;综合CoPht1的脂肪系数与总平均亲水性来分析，可以判定CoPht1是一个疏水性蛋白;CoPht1与其他物种的PHT1氨基酸序列具有较高的相似性，其中与夹竹桃科长春花的PHT1相似性最高，达到88％;蛋白质二级结构和拓扑结构预测表明，CoPht1具有跨膜蛋白的主要特征，与其他物种的PHT1具有一致性。以基因组DNA为模板设计引物扩增油茶PHT1基因的基因组序列，测序并将该序列与该基因的cDNA序列进行比对，结果显示:油茶CoPht1基因组序列与cDNA序列相同，没有内含子。 2.不同磷水平下油茶PHT1基因在不同器官中的表达。利用标准曲线优化的体系进行qRT-PCR，检测不同磷水平下CoPht1在不同器官下的相对表达量。在0.1 mmol/L磷水平下，CoPht1在嫩根中相对表达量最大，其次是老根、茎、新叶、老叶;在1.0mmol/L的磷水平下，CoPht1相对表达量依次是老根＞根＞茎＞老叶＞新叶。本研究还发现，在磷水平为0.1 mmol/L时，油茶嫩根中PHT1的相对表达量明显高于磷水平为1 mmol/L，表明低磷会诱导PHT1的表达，这和在其他物种上的研究一致。 3.油茶PHT1基因在转基因烟草中的表达。利用DNA重组技术成功构建了植物超表达载体pCAMBIA1304-35s-CoPht1，转化至根癌农杆菌GV3101中。通过叶盘法侵染野生型的烟草，并通过在培养基中加入潮霉素来筛选阳性植株。利用PCR扩增及GUS染色方法鉴定转基因植株。以抗性植株的总DNA为模板，以未转化的植株为阴性对照，以质粒DNA为阳性对照，利用超表达载体中GUS序列设计的引物进行PCR扩增。结果显示:转基因植株扩增的条带和质粒中的目的条带一致，而未转化植株没有扩增出任何条带。以抗性植株的根系和未转化植物的根系作为样本进行 GUS染色。结果表明:样本经过GUS染色变为蓝色是转基因植物的根系，而未侵染植株根系颜色为白色。

目录

声明

摘要

缩略词(Abbreviation)

1 绪言

1．1 油茶概述

1．2 油茶栽培所面临的问题

1．3 植物对磷元素的吸收和利用

1．3．1 植物磷素营养的生理功能

1．3．2 植物对磷素吸收

1．3．3 植物体内磷素运输

1．4 植物缺磷响应机制

1．4．1 低磷胁迫下的植物生理变化

1．4．2 低磷胁迫下的植物生化变化

1．5 PHT1家族磷酸盐转运蛋白基因的研究进展

1．5．1 PHT1家族成员的结构

1．5．2 PHT1家族成员的表达

1．5．3 PHT1基因的功能鉴定

1．6 本研究的目的意义，技术路线及主要内容

1．6．1 目的意义

1．6．2 技术路线

1．6．3 研究方法及内容

2 油茶PHT1基因的cDNA克隆、基因组克隆及生物信息学分析

2．1 试验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 实验药品

2．1．3 仪器设备

2．2 实验方法及步骤

2．2．1 油茶根系总RNA的制备

2．2．2 RNA电泳检测

2．2．3 反转录合成cDNA第一条链

2．2．4 保守区域的扩增

2．2．5 5’ cDNA末端扩增

2．2．6 3’ cDNA末端扩增

2．2．7 油茶PHT1基因全长的克隆

2．2．8 油茶PHT1基因组的克隆

2．2．9 序列分析与结构预测

2．3 结果与分析

2．3．1 油茶根系总RNA提取及检测

2．3．2 油茶PHT1基因全长克隆

2．3．3 油茶PHT1基因组扩增

2．3．4 油茶PHT1基因生物信息分析

2．4 讨论

3 油茶PHT1基因的表达模式

3．1 试验材料

3．1．1 植物材料

3．1．2 实验药品

3．1．3 仪器设备

3．2 实验方法及步骤

3．2．1 不同组织总RNA提取与cDNA样品制备

3．2．2 引物设计

3．2．3 qRT-PCR分析基因表达

3．3 结果与分析

3．3．1 总RNA提取

3．3．2 RT-PCR反应

3．3．3 qRT-PCR引物的特异性检测

3．3．4 油茶PHT1基因与内参基因的标准曲线

3．3．5 qRT-PCR检测油茶PHT1基因在不同磷水平下的表达模式

3．4 讨论

4 油茶PHT1基因的真核表达

4．1 试验材料

4．1．1 植物材料与菌株

4．1．2 实验药品

4．1．3 仪器设备

4．2 实验方法及步骤

4．2．1 中间过渡表达载体pCAMBIA-1304-35S的验证

4．2．2 基因片段的制备

4．2．3 超表达载体pCAMBIA1304-35s-CoPht1的构建

4．2．4 超表达载体转化农杆菌

4．2．5 野生型烟草的培养

4．2．6 叶盘法转化烟草

4．2．7 转基因烟草的阳性鉴定

4．3 结果与分析

4．3．1 中间过渡载体pCAMBIA-1304-35S的验证

4．3．2 植物表达载体构建

4．3．3 农杆菌阳性克隆鉴定

4．3．4 转基因植株获得及鉴定

4．4 讨论

5 结论与创新点

5．1 结论

5．2 创新点

参考文献

附录A：常用实验药品配方

附录B：GenBank序列提交信息

附录C：攻读硕士学位期间的主要学术成果

致谢