Cr（Ⅵ）在细胞p53封闭条件下的线粒体损伤效应

摘要

目的：在体外试验系统，研究Cr(Ⅵ)在p53封闭条件下对L-02肝细胞线粒体的损害效应，为进一步探讨Cr(Ⅵ)诱导细胞凋亡的独立线粒体依赖性途径奠定实验基础。 方法：以L-02肝细胞为受试细胞，通过MTT试验分别检测p53抑制剂(PFT-α)单独及其与Cr(Ⅵ)共处理对L-02肝细胞存活率的影响，并检测细胞核内p53蛋白表达验证PFT-α对p53的抑制作用，筛选出有效的PFT-α及Cr(Ⅵ)作用浓度。其后续试验PFT-α浓度定为20μmol/L，预处理4h，Cr(Ⅵ)浓度为20μmol/L，染毒时间为24h。将L-02肝细胞随机分成对照细胞组(第1组)、Cr(Ⅵ)染毒组(第2组)、PFT-α预处理对照细胞组(第3组)、PFT-α+Cr(Ⅵ)染毒组(第4组)、PFT-α+Z-VAD-fmk+Cr(Ⅵ)染毒组(第5组)、PFT-α+NAC+Cr(Ⅵ)染毒组(第6组)。化学比色法检测细胞氧化损伤；荧光分光光度法检测线粒体通透性转运孔(PTP)、跨膜电位(Δψm)的变化；western blotting检测细胞色素C(Cyt C)和凋亡诱导因子(AIF)的蛋白含量；RT-PCR检测Bcl-2及Bax的基因表达水平；DNA ladder检测细胞凋亡。 结果： 1.20μmol/L PFT-α预处理细胞后可以明显抑制细胞核内p53蛋白表达水平。 2.染毒处理细胞氧化损伤：Cr(Ⅵ)、PFT-α+Cr(Ⅵ)染毒组与PFT-α十Z-VAD-fmk-Cr(Ⅵ)染毒组引起SOD、GST活性明显降低，GSH含量减少，MDA生成增多，与对照组比较差异有显著性(P<0.05)；加入NAC后有明显保护作用。 3.细胞线粒体膜损伤：与对照组相比Cr(Ⅵ)染毒组、PFT-α+Cr(Ⅵ)染毒组和PFT-α+Z-VAD-fmk+Cr(Ⅵ)染毒组细胞线粒体膜电位(△ψm)降低，PTP开放度增加，差异有显著性(P<0.05)。加入NAC后有相应的拮抗作用。 4.细胞凋亡相关调控因子释放：与对照组相比Cr(Ⅵ)染毒组、PFT-α+Cr(Ⅵ)染毒组与PFT-α+Z-VAD-fmk+Cr(Ⅵ)染毒组细胞胞浆CytC和AIF蛋白增加，加入NAC后均出现明显减少(P<0.05)。 5.Bcl-2及Bax基因表达水平改变：与对照组相比Cr(Ⅵ)染毒组、PFT-α+Cr(Ⅵ)染毒组与PFT-α+Z-VAD-fmk+Cr(Ⅵ)染毒组细胞Bcl-2和Bax基因表达减少，加入NAC后均出现相应基因表达的增多。 6.细胞核DNA损伤：Cr(Ⅵ)、PFT-α+Cr(Ⅵ)与PFT-α+Z-VAD-fmk＋Cr(Ⅵ)染毒组细胞均出现凋亡典型的DNA梯带降解现象，加入NAC后未见明显保护作用。 结论：p53封闭条件下，20μmol/L Cr(Ⅵ)能明显引起L-02肝细胞氧化应激，导致线粒体膜损伤、cyt C与凋亡诱导因子(AIF)释放与细胞DNA损伤；同时在抑制caspase条件下，受试细胞仍然表现凋亡现象。结果提示，Cr(Ⅵ)可能绕过p53/caspase环节直接通过损伤细胞线粒体而诱导凋亡。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

第二章材料与方法

2.1材料

2.1.1受试细胞

2.1.2主要试剂

2.1.3实验溶液配制

2.1.4主要仪器

2.2方法

2.2.1实验技术路线

2.2.2肝细胞培养

2.2.3肝细胞生存率测定(MTT法)

2.2.4 Western Blotting法检测细胞核内p53蛋白含量

2.2.5细胞氧化损伤指标的测定(化学比色法)

2.2.6线粒体膜损伤

2.2.7 Western Blotting法检测细胞内细胞色素C及AIF蛋白含量

2.2.8逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测Bcl-2及Bax基因表达

2.2.9 DNA ladder定性检测细胞凋亡

2.3统计分析

第三章结果

3.1 PFT-α预处理后Cr(Ⅵ)对细胞存活率的影响

3.2 PFT-α预处理后细胞p53蛋白表达水平

3.3不同处理条件下Cr(Ⅵ)诱导的肝细胞氧化应激

3.4不同处理条件下Cr(Ⅵ)诱导的线粒体损伤

3.4.1不同处理组Cr(Ⅵ)对L-02肝细胞线粒体PTP开放度的影响

3.4.2不同处理组Cr(Ⅵ)对L-02肝细胞线粒体跨膜电位(△Ψm)的影响

3.5不同处理条件下Cr(Ⅵ)诱导的细胞凋亡相关调控因子水平改变

3.5.1 Western blotting检测胞浆细胞色素C和AIF表达水平

3.5.2 RT-PCR法检测Bcl-2和Bax基因表达水平

3.6 DNA ladder检测不同处理条件下Cr(Ⅵ)诱导的细胞凋亡

第四章讨论

4.1不同处理组Cr(Ⅵ)诱导肝细胞氧化损伤

4.2 p53封闭条件下Cr(Ⅵ)诱导细胞凋亡

4.3 p53封闭条件下，Cr(Ⅵ)对线粒体的损伤

4.3.1 PTP开放在Cr(Ⅵ)诱导细胞线粒体损伤中的作用机制

4.3.2 Cr(Ⅵ)诱导细胞损伤中线粒体Cyt C释放的调节机制

4.3.3 AIF在Cr(Ⅵ)诱导细胞凋亡中的调节机制

4.3.4 Bcl-2及Bax在Cr(Ⅵ)诱导细胞凋亡中的线粒体途径中的调节机制

4.3.5 caspase在Cr(Ⅵ)损伤细胞线粒体中的调控机制

4.3.6 NAC在Cr(Ⅵ)损伤细胞中的保护作用

第五章结论

参考文献

综述 线粒体在细胞凋亡调控中的作用

附录1 英文缩略表

致谢

研究生期间的成绩