前体物质对西洋参愈伤组织生长及代谢的影响研究

摘要

本试验以三年生西洋参根和10日龄实生苗的茎、叶为外植体，进行愈伤组织诱导试验。结果表明，各种外植体在相同诱导条件下均能诱导出愈伤组织，根的诱导率较低，茎和叶的诱导率差异不大。从基质中的蔗糖浓度和生长调节物质两方面优化了西洋参愈伤组织无性系的培养条件，筛选出以改良MS培养基为基本培养基，添加3％蔗糖、3.0mg/L 2,4-D、0.5mg/L BA的基质为最佳培养基。通过对培养物的生长量及皂苷含量的定期检测，确定了西洋参愈伤组织的最适生长周期为35d，此时，培养物的皂苷产率最高，为1.5％。 运用前体饲喂的方法，研究了丙酮酸钠、丙酮酸、α-蒎烯和角鲨烯四种前体物质对西洋参愈伤组织生长和皂苷合成的调控，以及其对西洋参培养物中过氧化物酶、过氧化氢酶和多酚氧化酶活力的影响。结果表明，除丙酮酸以外，其它三种前体均对西洋参愈伤组织培养物的皂苷合成和生长有促进作用。 在培养初期向培养基中添加不同浓度的丙酮酸钠溶液，培养一个周期后收获，测定愈伤组织的生长量、皂苷含量和酶活力，确定了丙酮酸钠的最适添加浓度为5mmol/L，此浓度下，培养物的生长量、皂苷含量及过氧化物酶、过氧化氢酶活力均达到最高值，分别是对照组的1.38倍、2.2倍、4.8倍、2.2倍。多酚氧化酶活力达最低值，是对照的57％。通过HPLC法对添加了5mmol/L丙酮酸钠的培养物所得皂苷样品进行单体皂苷分析，结果发现，经丙酮酸钠处理后的样品中人参皂苷Rg1和Rg2显著增加，而Rb2的含量明显下降。说明丙酮酸钠有利于皂苷中的Rg1和Rg2的合成。 在培养物培养14d后，向基质中添加不同浓度的丙酮酸，研究培养物的生长、皂苷合成和过氧化物酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶酶活力变化的动力学特征。结果显示，丙酮酸对培养物的生长有强抑制作用。不论添加浓度的大小和作用时间的长短，所得培养物的生长量、皂苷含量和过氧化物酶、过氧化氢酶的酶活力都低于对照组，多酚氧化酶活力明显高于对照。从而确定丙酮酸抑制了西洋参愈伤组织的代谢调。 研究了不同浓度、不同添加时间和不同作用时间的情况下α-蒎烯对西洋参愈伤组织代谢的调控。确定了α-蒎烯的最适添加浓度为0.2mmol/L，最佳添加时间为培养第14d，最佳作用时间为15d，以这种方式处理后的西洋参愈伤组织皂苷含量比对照组高88.8％。同时，测量了经α-蒎烯处理后，愈伤组织中的过氧化物酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶的活力，进一步证实了试验所确定的最适浓度、最佳添加时间、最佳作用时间的正确性。在愈伤组织培养的第14 d，向基质中添加不同浓度的角鲨烯，培养一个周期后，测量培养物的生长量和皂苷含量，同时，测量经处理后的愈伤组织中的过氧化物酶、过氧化氢酶和多酚氧化酶的活力。选择出了角鲨烯的最佳添加浓度为0.2mmol/L, 此时，皂苷含量、过氧化物酶和过氧化氢酶活力均达到最大，分别比对照高出123％、24％、2％。多酚氧化酶活力达最低。 通过正交实验研究了丙酮酸钠、α-蒎烯和角鲨烯三种前体的协同作用。分析结果显示，丙酮酸钠对培养物的作用效果最显著，α-蒎烯次之，角鲨烯作用效果最小，但也达到了显著水平。促进西洋参愈伤组织培养物中皂苷合成的最佳前体组合为5mmol/L 丙酮酸钠，0.2mmol/L，α-蒎烯，0.2mmol/L角鲨烯。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：主要符号表

声明

第一章前言

1西洋参的研究现状

1.1西洋参中化学成分研究现状

1.2西洋参组织和细胞培养研究进展

1.3西洋参的药理作用

2三萜皂苷生物合成研究进展

2.1三萜皂苷的结构和性质

2.2三萜皂苷的合成途径

3三萜皂苷合成的调控

4前体饲喂的研究现状

4.1前体物质对萜类化合物合成途径中关键酶的影响

4.2前体物质在萜类化合物合成中的应用

4.3前体饲喂研究中存在的问题

5研究目的与意义

第二章材料与方法

1实验材料

2仪器与试剂

2.1实验仪器

2.2药品的制备

3试验方法

3.1西洋参愈伤组织无性系的建立

3.2前体饲喂

3.3愈伤组织生长量的测定

3.4愈伤组织中人参皂苷的提取与检测

3.5酶活力的测定

第三章结果与分析

1西洋参愈伤组织无性系的建立

1.1愈伤组织诱导

1.2愈伤组织培养基质的优化

1.3西洋参愈伤组织生长周期的确定

1.4继代时间对西洋参愈伤组织生长及皂苷合成的影响

2前体物质对西洋参愈伤组织生长及代谢作用的影响

2.1丙酮酸钠对西洋参愈伤组织生长及代谢作用的影响

2.2丙酮酸对西洋参愈伤组织生长及代谢的影响

2.3 α-蒎烯对西洋参愈伤组织生长及代谢作用的影响

2.4角鲨烯对西洋参愈伤组织生长及代谢作用的影响

2.5三种前体协同作用的研究

第四章讨论与结论

1 讨论

1.1愈伤组织的诱导及培养基质的优化

1.2前体饲喂对愈伤组织皂苷合成的影响

1.3过氧化物酶活力与培养物生长及皂苷含量的关系

1.4过氧化氢酶活力与培养物生长及皂苷含量的关系

1.5多酚氧化酶活力与培养物生长及皂苷含量的关系

1.6前体物质对单体皂苷合成的影响

2结论

2.1愈伤组织的诱导及培养基质的优化

2.2丙酮酸钠对西洋参愈伤组织生长及代谢的调控

2.3丙酮酸对西洋参愈伤组织生长及代谢的调控

2.4α-蒎烯对西洋参愈伤组织生长及代谢的调控

2.5角鲨烯对西洋参愈伤组织生长及代谢的调控

2.6前体的协同作用

参考文献

附录

致谢

个人简历