田鼠型鼠疫菌在人和小鼠巨噬细胞内抗吞噬溶酶体的差异性研究

摘要

目的：本研究通过体外细胞实验，验证青海田鼠型鼠疫菌在感染人和小鼠巨噬细胞后，对细胞吞噬溶酶体抵抗能力是否存在差异。 方法：本研究首先通过胞内生存实验比较青海田鼠型鼠疫菌（Y.pestis201）在人和小鼠巨噬细胞内的生存能力差别，再分别用化学荧光和免疫荧光方法观察田鼠型鼠疫菌与人和小鼠巨噬细胞的溶酶体及其各阶段标志物Rab5、Rab7和Lamp1共定位的情况，然后通过蛋白免疫印迹方法检测田鼠型鼠疫菌感染的人和小鼠巨噬细胞中吞噬溶酶体相关基因表达产物，如组织蛋白酶（CTSZ、CTSD）、AP1复合体（AP1S1）、Fe2+通道蛋白（MCOLN1）、Fe2+反向转运蛋白（Slc11a1）的表达情况，以比较田鼠型鼠疫菌在人和小鼠巨噬细胞中对吞噬溶酶体的抵抗能力差异。 结果：胞内生存实验表明Y.pestis201在U937来源的人巨噬细胞中生存能力较弱，32h内被清除；但是在小鼠巨噬细胞RAW264.7中生存能力较强，32h存活率约40%。化学荧光染色和免疫荧光实验表明：Y.pestis201在U937来源的巨噬细胞中能够与溶酶体以及溶酶体各阶段标志物Rab5、Rab7和Lamp1存在共定位，不能形成可供Y.pestis201复制的含菌囊泡（YCV）；然而Y.pestis201在RAW264.7中与溶酶体以及溶酶体各阶段膜表面标志物均无共定位，且形成有鼠疫菌大量复制的YCV。免疫印迹实验发现，Y.pestis201感染U937来源的巨噬细胞和RAW264.7细胞后，CTSZ、CTSD、AP1S1、MCOLN1在U937来源的巨噬细胞中表达量较RAW264.7中高；但pH依赖性Slc11a1在RAW264.7中表达量较高。 结论：田鼠型鼠疫菌在小鼠巨噬细胞中对吞噬溶酶体的抵抗能力比在人巨噬细胞中强。

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主要中英文缩写索引

第1章 前 言

第2章 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌株和细胞系

2.1.2 质粒

2.1.3 主要试剂与耗材

2.1.4 主要仪器

2.1.5 实验相关溶液配制

2.2 实验方法

2.2.1 田鼠型鼠疫菌在人和小鼠巨噬细胞内生存率比较

2.2.2 荧光显微镜观察田鼠型鼠疫菌在人和小鼠巨噬细胞内的存活情况

2.2.3 初步验证田鼠型鼠疫菌与细胞中吞噬溶酶体共定位情况

2.2.4 溶酶体各阶段膜表面标志物与田鼠型鼠疫菌的共定位情况

2.2.5验证Y. pestis201感染的巨噬细胞中溶酶体相关基因表达

第3章 实验结果

3.1田鼠型疫菌在人和小鼠巨噬细胞中的生存能力比较

3.1.1人和小鼠巨噬细胞对田鼠型鼠疫菌的粘附吞噬比较

3.1.2田鼠型鼠疫菌在小鼠巨噬细胞和人巨噬细胞中的生存率变化

3.1.3 通过荧光显微镜观察田鼠型鼠疫菌在人和小鼠巨噬细胞中生存情况

3.2化学荧光检测人和小鼠巨噬细胞中吞噬溶酶体与田鼠型鼠疫菌的共定位情况

3.2.1pACYC184-GFP质粒电转入Y. pestis201以及诱导表达

3.2.2 人巨噬细胞中吞噬溶酶体与田鼠型鼠疫菌的存在共定位

3.2.3 小鼠巨噬细胞中吞噬溶酶体与田鼠型鼠疫菌不存在共定位

3.3人巨噬细胞感染田鼠型鼠疫菌后吞噬体对溶酶体膜表面标志物Lamp1、Rab7、Rab5的招募情况

3.3.1 人巨噬细胞感染田鼠型鼠疫菌后吞噬体对Lamp1的招募不受影响

3.3.2 人巨噬细胞感染田鼠型鼠疫菌后吞噬体对Rab7的招募不受影响

3.3.3 人巨噬细胞感染田鼠型鼠疫菌后吞噬体对Rab5的招募不受影响

3.4小鼠巨噬细胞感染田鼠型鼠疫菌后吞噬体对溶酶体膜表面标志物Lamp1、Rab7、Rab5的招募情况

3.4.1 小鼠巨噬细胞感染田鼠型鼠疫菌后吞噬体对Lamp1的招募受到抑制

3.4.2 小鼠巨噬细胞感染田鼠型鼠疫菌后吞噬体对Rab7的招募受到抑制

3.4.3 小鼠巨噬细胞感染田鼠型鼠疫菌后吞噬体对Rab5的招募受到抑制

3.5 田鼠型鼠疫菌感染的人和小鼠巨噬细胞中溶酶体相关基因表达存在差异

3.5.1 CTSZ在人和小鼠 巨噬 细胞中表达量的差异

3.5.2 CTSD在人和小鼠细胞中表达量的差异

3.5.3 AP1S1在人和小鼠细胞中表达量的差异

3.5.4 MCOLN1在人和小鼠细胞中表达量的差异

3.5.5 SLC11A1在人和小鼠细胞中表达量的差异

第4章 讨 论

第5章 结 论

参考文献

综述:Bacterial pathogens subvert the phagolysosome pathway for intracellular survival and pathogenesis

攻读学位期间的科研成果

致谢