金鱼PR55/B家族基因cDNA的克隆及表达分析

摘要

蛋白质的可逆磷酸化修饰，是生物体内普遍存在的信号传导调节方式。蛋白磷酸酶行使的去磷酸化作用在调控细胞内各种生命过程中起了重要的作用。PP2A是主要的丝/苏氨酸蛋白磷酸酶之一，它参与DNA复制、转录、细胞周期调控、信号转导等生命活动。PR55/B家族是PP2A已知的调节亚基家族之一。
　　 本文运用RACE和RT-PCR技术克隆得到金鱼PP2A调节亚基PR55/B家族中PR55δ，PR55β基因全长序列以及PR55γ基因编码区部分序列。结果显示PR55δ基因全长2163bp，其中编码区1347bp编码，推测编码448aa的序列。PR55β基因全长1940bp，其中编码区1332bp编码，推测编码443aa的序列。PR55γ基因部分cDNA长1218bp，编码的多肽共含405个氨基酸。通过序列分析发现PR55/B家族各亚基基因编码的蛋白与已知其他物种对应的蛋白质均有着很高的同源性。通过系统发育树的构建发现其系统发育关系与传统的分类基本一致，符合脊椎动物的进化规律，暗示了该家族基因在进化上和功能上的保守性。但是PR55δ和PR55β在氨基末端有显著差异，可能与各调节亚基功能，如决定底物特异性和细胞内定位有关。运用ExPASy和SMART等序列分析软件在PR55δ、PR55β、PR55γ三个基因推测的蛋白质中分别找到了WD40重复序列结构。PR55/B家族成员在WD40重复序列上的保守性使我们推测这一结构作为与PP2A结构亚基A相结合的区域，为PR55/B家族调节亚基参与PP2A三聚体的装配提供了支点。
　　 在组织表达方面，金鱼PR55/B家族基因呈现明显的差异性表达。PR55δ基因的mRNA和蛋白水平都在各个组织中呈现广泛但不均一的表达。PR55β基因的mRNA和蛋白表达仅在大脑和心脏中检测到。PR55γ基因mRNA特异表达于在大脑和鳍中。其中，PR55β基因在心脏中的表达和PR55γ基因在鳍中的表达是第一次报道。而且金鱼(低等脊椎动物)PR55/B在组织中的表达模式与小鼠(高等脊椎动物)有显著的差异。这也提示我们PR55β基因可能在鱼类(低等脊椎动物)心脏的发育和心脏组织行驶功能时具有非常重要的作用。而PR55γ基因在调控金鱼鳍的发育和功能方面也可能具有不可替代的作用。
　　 在金鱼胚胎发育过程中，PR55δ基因的mRNA和蛋白以及PR55β的mRNA基因在胚胎发育的各个时期都有较高表达。但是，我们没有检测到PR55β基因在蛋白水平上的表达。PR55δ和PR55β基因在金鱼胚胎中的表达模式与小鼠胚胎中的表达模式又呈现了明显的差异，它们可能在调节不同物种的发育中有着不同的作用。PR55γ基因的mRNA在胚胎发育早期没有表达，直到神经胚期才开始出现，随后呈现逐渐升高的表达模式。PR55γ基因从神经胚开始表达的特点让我们推测它在神经发育系统中的重要作用。
　　 另外，我们设计构建PR55δ基因反义表达载体，通过显微注射到金鱼胚胎来抑制PR55δ基因的表达，观察其对胚胎发育的影响。结果表明，当PR55δ基因表达下调后，金鱼胚胎出现了不正常的组织器官分化。脑和眼的发育受到了影响，表现为无脑、脑发育缓慢、无眼、小眼等。这些结果证明了PP2A调节亚基直接控制着组织器官生成，PR55δ基因对于金鱼胚胎发育是至关重要的。
　　 综上所述，我们的结果表明PR55/B家族在可能在金鱼不同组织和胚胎发育的不同时期过程中起着多种重要作用。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

1.蛋白磷酸酶2A(PP2A)

1.1 PP2A的结构

1.2 PP2A调节亚基B家族

1.3 PP2A的功能

2.反义核酸

第一章金鱼PR55/B家族基因的cDNA克隆

1实验材料和方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2实验结果

2.1金鱼PR55δ基因的cDNA克隆及序列同源性比较

2.2金鱼PR55β基因的cDNA克隆及序列同源性比较

2.3金鱼PR55γ基因的cDNA克隆及序列同源性比较

2.4金鱼PR55家族各亚基同源性比较

2.5 PR55δ、PR55β和PR55γ系统发育分析

3.讨论

第二章PR55δ、PR55β、PR55γ基因在金鱼不同组织和不同胚胎发育时期中的分化表达模式

1材料和方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2实验结果

2.1 PR55δ、PR55β和PR55γ基因在金鱼不同组织mRNA水平的表达

2.2 PR55δ和PR55β基因在金鱼不同组织的蛋白水平表达

2.3 PR55δ、PR55β和PR55γ基因在金鱼胚胎不同发育时期中mRNA水平的表达

2.4 PR55δ和PR55β基因在金鱼胚胎不同发育时期蛋白水平的表达

3讨论

第三章PR55δ基因功能机制研究

1材料和方法

1.1材料

1.2实验方法

2.实验结果

2.1蛋白水平检测显微注射后胚胎PR55δ表达水平

2.2显微注射后金鱼胚胎发育状况

3.讨论

参考文献

附 录:硕士学习期间撰写、发表的主要论文情况

致 谢