增龄与Clk基因表达下调对果蝇睡眠--活动节律和心跳节律的影响及运动干预效果研究

摘要

1.研究目的： 以果蝇为模式生物，在转基因技术的基础上，利用Gal4-UAS系统分别建立大脑主钟Clk基因敲减品系及心脏外周时钟Clk基因敲减品系果蝇，并给予规律运动，研究增龄与主钟或心脏外周时钟Clk基因敲减对以睡眠-觉醒为代表的自主活动、以心跳节律为代表的生理活动的影响，并观察运动能否改善病理或生理性节律衰退，拟为运动在节律失调方面的治疗提供理论依据。 2.研究方法： UAS-Clk RNAi品系处女蝇分别与雄性W1118、Pdf-Gal4、Hand-Gal4杂交，各杂交组F1代处女蝇分别为基因正常表达对照组（Clk RNAi/+）、大脑Clk基因敲减组(Pdf＞Clk RNAi)、心脏Clk基因敲减组(Hand＞Clk RNAi)，各组收集处女蝇1200只随机分为3周龄安静组(3W_C)、6周龄安静组(6W_C)和6周龄运动组(6W_E)。 运动装置采用本实验室自主研发的果蝇运动转动装置，运动方式为以垂直地面开始的180°的翻转运动，电机转速为240s/r，翻转后停留时间为15s。运动组果蝇从第22天龄开始进行持续3周的规律运动，每天运动2.5h，持续5天，休息2天，运动时间控制在上午9:00-12:00。 实时荧光定量PCR技术检测各组果蝇大脑和/或心脏中ClkmRNA的相对表达量，Western Blot检测各杂交组3W果蝇大脑和/或心脏中CLK蛋白相对表达量，控制大脑和心管的取材时间在上午9:00-12:00。果蝇行为监测系统(DAMS)监测各组果蝇睡眠-活动情况，其中3W果蝇子第20天龄18:00前放入DAMS中，6W果蝇于第41天龄18:00前放入，适应1天后取第二天的数据进行分析。EM-CCD高速摄像机和HC-Image软件记录并处理各组果蝇半暴露心脏跳动30s显微成像视频，用半自动光学心动分析软件(SOHA)进行分析心跳节律指标，并结合M-mode心动图，综合分析果蝇心跳节律和心律失常指标。 3.研究结果： 3.1 实时荧光定量PCR检测结果 随年龄增加，各组果蝇心脏及大脑Clk mRNA相对表达量降低。与同龄基因正常表达果蝇相比，大脑和心脏Clk基因敲减的3W_C和6W_C果蝇大脑和心脏中Clk mRNA均有不同程度降低。运动使基因正常表达果蝇大脑和心脏Clk mRNA相对表达量降低，而大脑Clk基因敲减果蝇Clk mRNA相对表达量有所增加，同样心脏Clk基因敲减果蝇运动后Clk mRNA相对表达量也有所增加。 3.2 Westem Blot检测结果 各杂交组果蝇大脑或心脏中均检测到CLK蛋白，且大脑和心脏Clk基因敲减组果蝇的蛋白表达量均有所下降，下降率分别为17％，13％。 3.3 果蝇睡眠-活动节律监测结果 与3W_C组果蝇相比，增龄使基因正常表达的6W_C果蝇夜间和白天的睡眠时间显著增多，活动次数显著降低，且每小时的活动次数也明显降低，在睡眠质量方面，6W_C果蝇夜间和白天第二次深睡眠次数增多，睡眠潜伏期显著下降;而增龄对大脑Clk基因敲减果蝇睡眠总时间和活动总次数、每小时的活动节律及睡眠质量指标没有显著影响;但心脏Clk基因敲减果蝇的增龄影响与基因正常表达果蝇类似，即夜间和白天的睡眠总时间增多，活动总次数降低，且每小时活动次数也呈增龄减少，睡眠质量指标方面，其夜间睡眠片段数增多，白天的第一次和第二次深睡眠的次数增多，睡眠潜伏期降低。 与基因正常表达果蝇相比，大脑Clk基因敲减的3W_C果蝇睡眠-活动量与基因正常表达的6W_C果蝇类似，即夜间、白天睡眠总时间增多、活动总次数及每小时的活动次数降低，睡眠质量方面则有所不同，表现为白天第一次深睡眠次数增多，夜间第二次深睡眠次数减少，因其活动减弱，睡眠潜伏期也有所降低。心脏Clk基因敲减3W_C果蝇白天睡眠总时间降低，夜间活动的总次数增多，白天睡眠片段数增多，其6W_C果蝇白天睡眠片段数、第一次深睡眠次数增多，夜间和白天大的第二次深睡眠次数降低。 运动干预对基因正常表达及大脑Clk基因敲减果蝇没有显著影响，但在心脏Clk基因敲减果蝇中，改善了由增龄引起的夜间和白天睡眠总时间增多，活动总次数及每小时的活动次数降低的状况，在睡眠质量指标方面也改善了由增龄或Clk mRNA表达降低引起的白天第一次和第二次深睡眠次数的增加。 3.4 果蝇心跳节律分析结果 与3W_C组相比，基因正常表达及大脑Clk基因敲减6W_C果蝇心率失常发生率显著增加，而在心脏Clk基因敲减果蝇中，没有表现出与年龄相关的心跳节律紊乱。 大脑和心脏Clk基因敲减增加了3W_C果蝇心跳节律不齐的发生，而大脑Clk基因敲的6W_C果蝇只表现出心动周期和心动过缓发生率增加，但心脏Clk基因敲减6W_C收缩间期和心动过缓发生率降低，其他节律指标无明显变化。 规律运动可降低大脑Clk基因敲减果蝇由增龄引起的心跳节律紊乱，但却使基因正常表达及心脏Clk基因敲减果蝇心律失常发生率增加。 4结论： 4.1 随年龄的增加，大脑Clk基因正常表达果蝇（基因正常表达组和心脏Clk基因敲减组）睡眠量增多，活动量降低;大脑Clk基因参与睡眠-活动节律和心跳节律的调节，其低表达可使果蝇提前进入衰老状态。 4.2 心脏Clk基因正常表达果蝇（基因正常表达组和大脑Clk基因敲减组）心跳节律呈增龄性衰退;心脏Clk基因主要参与心跳节律的调节，一定程度上影响果蝇的睡眠质量，但不参与睡眠-活动量的调节。 4.3 3周规律运动可改善心脏Clk基因敲减果蝇由增龄引起的活动减弱和日间深睡眠次数增多。 4.4 3周规律运动可降低大脑Clk基因敲减果蝇增龄引起的心跳节律不齐的发生，但增加了基因正常表达果蝇及心脏Clk基因敲减果蝇心跳节律不齐的发生。

目录

摘要

1前言

2．1实验材料

2．1．1实验动物

2．1．2果蝇饲养环境

2．1．3培养基的配备

2．1．4主要实验仪器及来源

2．1．5主要实验试剂及来源

2．2实验方法

2．2．1果蝇性别鉴定

2．2．2果蝇杂交与分组

2．2．3果蝇运动方案及取材安排

2．2．4果蝇取材方法

2．2．5实验指标检测

2．3统计学处理

3结果

3．1实时荧光定量PCR检测结果

3．2 Western Blot检测结果

3．3果蝇睡眠-活动节律监测结果

3．3．1果蝇睡眠量分析结果

3．3．2果蝇活动量分析结果

3．3．3果蝇睡眠质量分析结果

3．4果蝇心跳节律指标分析结果

3．4．1增龄和／或Clk基因敲减对果蝇心跳节律的影响

3．4．2运动对果蝇心跳节律的影响

4分析与讨论

4．1增龄与大脑或心脏C腩基因敲减对果蝇睡眠．活动的影响

4．2增龄与大脑或心脏C腩基因敲减对果蝇心脏节律的影响

4．3运动对增龄或Clk基因敲减果蝇睡眠．活动节律的影响

4．4运动对增龄或C腩基因敲减果蝇心脏节律的影响

5结论

参考文献

综述 节律基因Clk、增龄及运动对睡眠和心脏节律影响的研究进展

攻读硕士学位期间发表(参与发表)的论文

致谢

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