糖化酵母葡萄糖淀粉酶基因在酿酒酵母中克隆与表达

摘要

当前环境恶化、资源匮乏已经成为全球性问题，所以用乙醇作为一种新型燃料正更多的为人们所研究，开发新型的清洁能源是解决环境与资源等问题最直接有效的方式。在众多的化石燃料中，酒精燃烧不仅清洁、可再生而且不产生有毒和温室气体。目前采用遗传工程来构造出能够直接水解淀粉生成酒精的工程菌株，新型菌株可以以淀粉为原料高效生产酒精，并且使酒精产量大大提升。
　　在工业生产上，在以淀粉为原料生产葡萄糖果糖糖浆工艺中，葡萄糖淀粉酶被广泛利用。但现有葡萄糖淀粉酶菌株分泌表达量较低，本实验目的是将葡萄糖淀粉酶基因导入到酿酒酵母中以构建一株重组的酿酒酵母菌株，重组菌株能高效表达并分泌葡萄糖淀粉酶水解淀粉。
　　实验根据NCBI中Genebank数据库中的序列信息，采用PCR方法从糖化酵母中提取总DNA，并扩增出葡萄糖淀粉酶基因STA1，然后将PCR产物连入pUM-T载体构建成为重组质粒pUM-T-stal，将重组质粒转入大肠杆菌，并进行测序，成功克隆得到STA1重组质粒。将提取的重组质粒pUM-T-stal用BspDI和Acc65I酶切得到STA1并且转入到酿酒酵母表达质粒pRS416中，取名为pRS416-stal。重组质粒pRS416-stal转化入酿酒酵母感受态菌种中，获得高效表达STA1工程菌。
　　通过诱导表达，重组的酿酒酵母葡萄糖淀粉酶酶活最高为120U/mL。测定葡萄糖淀粉酶酶学性质，结果为其最适温度为60℃，40℃～70℃下稳定性良好;其最适pH为5，在pH为4～6之间稳定性良好。反应2h后酶活依然稳定，剩余酶活能达到90％以上。

目录

摘要

第一章 绪论

1．1 本题的来源及意义

1．2 淀粉酶简介

1．3 葡萄糖淀粉酶

1．3．1 葡萄糖淀粉酶的最适温度和pH

1．3．2 葡萄糖淀粉酶的结构和催化机理

1．3．3 葡萄糖淀粉酶基因的克隆和表达

1．4 酿酒酵母外源表达系统

1．4．1 酿酒酵母简介

1．4．2 酿酒酵母表达系统优点

1．4．3 酿酒酵母表达系统载体

第二章 材料和方法

2．1 主要材料

2．1．1 试剂及仪器

2．1．2 菌株及质粒

2．2 实验方法

2．2．1 培养基与溶液配制

2．2．2 菌株的培养

2．2．3 目的基因的提取

2．2．4 目的基因连接与转化

2．2．5 质粒提取与酶切

2．2．6 葡萄糖淀粉酶纯化

2．2．7 诱导表达目的蛋白

2．2．8 蛋白质SDS-PAGE电泳

2．2．9 葡萄糖淀粉酶酶活测定

2．2．10 重组质粒pRS416-sta1在酿酒酵母中的稳定性

第三章 结果与讨论

3．1 STA1基因的提取与鉴定

3．1．1 提取糖化酵母全基因组

3．1．2 STA1基因PCR引物与条件设计

3．1．3 重组克隆质粒pUM-T-sta1测序

3．2 pRS416-sta1重组表达质粒的构建及鉴定

3．2．1 pRS416-sta1重组表达质粒的构建

3．2．2 pRS416-sta1质粒鉴定

3．3 重组表达产物糖化酶的SDS-PAGE鉴定

3．4 葡萄糖淀粉酶酶活测定

3．4．1 酿酒酵母中葡萄糖淀粉酶的表达检测

3．4．2 葡萄糖淀粉酶最适温度与pH

3．4．3 葡萄糖淀粉酶稳定性

3．5 重组质粒在酿酒酵母中稳定性

3．6 讨论与展望

第四章 结论

致谢

参考文献

作者简介

攻读硕士学位期间研究成果

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