PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF复合神经导管的制备及其在周围神经修复中的应用

摘要

周围神经缺损是临床常见的创伤，严重影响患者的感觉运动功能，神经导管是对其修复治疗方面的研究热点，但目前临床使用的神经导管材料对于神经修复的作用依然有限，难以达到自体神经移植的修复效果。神经再生需要合适的引导环境和适当的促神经再生生物因子，据此，本文拟制备一种RGD多肽接枝聚(乳酸—羟基乙酸—L—赖氨酸)/聚乳酸/β—磷酸三钙/神经生长因子(PRGD/PDLLA/β—TCP/NGF)新型复合神经导管，并对其结构和性能进行表征，通过体外细胞培养和体内动物实验对其进行生物学评价，为临床周围神经缺损修复提供理论依据。 以Nε—苄氧羰基—L—赖氨酸和溴乙酰溴为起始原料，合成单体3S—[4-(苄氧羰基氨基)丁基]—吗啉—2，5-二酮，将该单体与D，L—丙交酯聚合生成聚(乳酸—羟基乙酸—Nε—苄氧羰基—L—赖氨酸)，再经催化氢解脱苄氧羰基制得聚(乳酸—羟基乙酸—L—赖氨酸)，最后通过L—赖氨酸的侧氨基引入短肽RGD，制得一种新型聚合物—RGD多肽接枝聚(乳酸—羟基乙酸—L—赖氨酸)。采用FT—IR，1H—NMR，13C—NMR，MS，GPC，AAA对中间产物和目标聚合物的结构进行了表征。结果表明：成功合成了3S—[4-(苄氧羰基氨基)丁基]—吗啉—2，5-二酮单体，可根据该单体和D，L—丙交酯投料比的不同在很大范围内调节聚(乳酸—羟基乙酸—Nε—苄氧羰基—L—赖氨酸)的组成，Pd/C催化氢解可完全脱除聚(乳酸—羟基乙酸—Nε—苄氧羰基—L—赖氨酸)中的苄氧羰基，PRGD中甘氨酸—精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸—酪氨酸(GRGDY)的含量为6.9～18.8μmol/g。通过改变GRGDY和PRGD的投料比，还可在很大范围内调节PRGD中GRGDY的含量。 通过对复合材料制备工艺、成膜性能影响因素的研究，本文选择在20℃、40％湿度下，以乙酸乙酯为溶剂，分别加入85％分子量为1.0×105～1.5×105聚乳酸，10％ PRGD，5％β—TCP(平均粒径<500nm)，0.0006％神经生长因子，采用溶剂挥发法制备PRGD/PDLLA/β—TCP/NGF复合膜，并对其结构和性能进行了表征。结果表明：复合膜中NGF在体外4h即释放211.6ng/mL，此后释放逐渐变缓。PRGD、β—TCP、NGF的加入可提高材料的亲水性，PRGD/PDLLA/β—TCP/NGF复合材料较聚乳酸亲水性有显著改善。PRGD/PDLLA/β—TCP/NGF膜的拉伸强度为5.7±0.23 MPa，断裂伸长率(％)为1631.34±228.66。PRGD/PDLLA/β—TCP/NGF管的环刚度为168.93±20.24 KPa，压缩永久变形(％)为15.85±0.69。PRGD/PDLLA/β—TCP/NGF导管较柔韧，便于手术缝合，且具有一定的抗压弹性和支撑力，能够满足神经导管的力学性能要求。 对复合膜进行体外降解研究，测定降解过程中降解介质pH值的变化、复合膜的质量损耗率、分子量的变化，观察复合膜的大体形貌及微观结构的变化。结果表明：β—TCP可以中和聚乳酸、PRGD降解产物的酸性，有效调节降解介质的pH值使其维持在中性。PRGD、NGF的加入可促进复合膜的降解，PRGD/PDLLA/β—TCP/NGF复合材料较聚乳酸具有更好的降解性能。 将RSC96雪旺细胞与材料体外复合培养，通过四唑盐(MTT)比色法测各组材料表面黏附细胞的吸光度(OD)值来评价材料表面细胞活性，扫描电镜观察细胞在材料表面的生长状态，结果表明PRGD/PDLLA/β—TCP/NGF复合材料具有良好的神经细胞亲和性，能促进RSC96雪旺细胞在材料表面黏附、增殖和生长。 以PRGD/PDLLA/β—TCP/NGF、PRGD/PDLLA/β—TCP、PDLLA导管和自体神经桥接大鼠坐骨神经10mm缺损。术后3个月从大体观察、电生理测定、三头肌湿重测量、再生神经组织学及图像分析等指标检测比较各组坐骨神经的再生情况。结果显示：(1)PRGD/PDLLA/β—TCP复合导管组再生神经纤维的质量和数量显著优于PDLLA导管组，PRGD/PDLLA/β—TCP复合导管较PDLLA导管更有利于神经再生。(2)PRGD/PDLLA/β—TCP/NGF复合导管有良好的组织相容性，能够有效促进周围神经再生，效果显著优于PRGD/PDLLA/β—TCP复合导管和PDLLA导管，接近自体神经移植。该研究结果，有望为PRGD/PDLLA/β—TCP/NGF复合导管的临床应用提供理论依据。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章绪论

1.1引言

1.2周围神经损伤与再生

1.3周围神经损伤的修复方法

1.3.1神经缝合

1.3.2神经移植

1.3.3神经导管

1.4周围神经再生微环境

1.4.1雪旺细胞

1.4.2基底膜

1.4.3神经生长因子

1.5 RGD多肽的研究进展

1.5.1 RGD多肽的生物学效应

1.5.2在材料本体中引入RGD多肽

1.5.3经表面修饰引入RGD多肽

1.6有机／无机复合材料主要复合方法

1.6.1物理复合中的直接共混方法

1.6.2叠层复合方法

1.6.3以聚合物溶液为介质的湿法复合

1.7本论文研究的目的和主要研究内容

第2章RGD多肽接枝聚(乳酸-羟基乙酸-L-赖氨酸)的制备与表征

2.1引言

2.2主要试剂和仪器

2.3实验方法

2.3.1 RGD多肽接枝聚(乳酸-羟基乙酸-L-赖氨酸)的合成路线

2.3.2单体3S-[4-(苄氧羰基氨基)丁基]-吗啉-2,5-二酮(3)的制备

2.3.3聚(乳酸-羟基乙酸-Nε-苄氧羰基-L-赖氨酸)(5)的制备

2.3.4聚(乳酸-羟基乙酸-L-赖氨酸)(6)的制备

2.3.5 RGD多肽接枝聚(乳酸-羟基乙酸-L-赖氨酸)(7)的制备

2.4结果与讨论

2.4.1 3S-[4-(苄氧羰基氨基)丁基]-吗啉-2,5-二酮的合成及表征

2.4.2聚(乳酸-羟基乙酸-Nε-苄氧羰基-L-赖氨酸)的制备及表征

2.4.3聚(乳酸-羟基乙酸-L-赖氨酸)的制备及表征

2.4.4 RGD多肽接枝聚(乳酸-羟基乙酸-L-赖氨酸)的制备及表征

2.5本章小结

第3章PRGD／PDLLA/β-TCP／NGF复合材料的制备与表征

3.1引言

3.2实验部分

3.2.1主要试剂、材料与设备

3.2.2 PRGD／PDLLA／β-TCP／NGF复合材料的制备

3.2.3形貌分析

3.2.4成分分析

3.2.5复合材料中NGF的释放性能

3.2.6静态水接触角测试

3.2.7机械性能

3.3结果与讨论

3.3.1 PRGD／PDLLA/β-TCP／NGF复合材料的制备

3.3.2形貌观察

3.3.3成分分析

3.3.4 NGF体外释放研究

3.3.5亲／疏水性评价

3.3.6机械性能测试

3.4本章小结

第4章PRGD／PDLLA/β-TCP／NGF复合材料生物相容性研究

4.1引言

4.2实验部分

4.2.1主要试剂、材料与设备

4.2.2 RSC96雪旺细胞的传代培养

4.2.3 RSC96雪旺细胞的生长曲线

4.2.4复合材料MTT实验

4.2.5材料表面细胞扫描电镜观察

4.3实验结果

4.3.1 RSC96细胞的传代培养

4.3.2 RSC96雪旺细胞的生长曲线

4.3.3复合材料MTT实验

4.3.4材料表面细胞扫描电镜观察

4.4讨论

4.5本章小结

第5章PRGD／PDLLA/β-TCP／NGF复合材料体外降解研究

5.1引言

5.2实验材料与仪器

5.2.1主要试剂与材料

5.2.2仪器

5.3实验方法

5.3.1 pH值变化的测定

5.3.2材料的失重率测定

5.3.3材料的分子量测定

5.3.4材料结构观察

5.4结果

5.4.1降解介质pH值的变化

5.4.2材料的失重率测定

5.4.3材料分子量的变化

5.4.4形貌观察

5.5讨论

5.5.1 PDLLA的降解

5.5.2 β-TCP的降解

5.5.3 PRGD／PDLLA/β-TCP／NGF复合材料的降解

5.6本章小结

第6章PRGD／PDLLA/β-TCP／NGF复合神经导管的动物试验研究

6.1引言

6.2实验材料与方法

6.2.1实验动物与分组

6.2.2实验方法

6.3实验结果

6.3.1大体观察

6.3.2电生理检测

6.3.3小腿三头肌湿重恢复率测量

6.3.4组织学观察

6.3.5图像分析

6.3.6材料的扫描电镜观察

6.4讨论

6.5本章小结

第7章结论

参考文献

攻读博士学位期间发表的论文及申报的专利

致谢