靶向抑制胰岛素样生长因子--1受体治疗鼻咽癌的实验研究

摘要

全文由四部分组成。 第一部分 胰岛素样生长因子-Ⅰ受体蛋白在鼻咽癌细胞中的表达及其临床意义 目的:探讨鼻咽癌组织中胰岛素样生长因子1受体(1GF-1R)蛋白的表达及其临床意义。 方法:采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术和免疫组织化学方法检测63例鼻咽癌组织和鼻咽部炎性粘膜组织中IGF-1R的表达，对其中45例鼻咽癌患者进行随访观察5年，并采用免疫印迹技术(Western blots)检测三种体外培养的鼻咽癌细胞株中IGF-1R蛋白的表达情况。 结果:在鼻咽癌组织中IGF-1RmRNA和蛋白的表达明显高于鼻咽慢性炎症组织。63例鼻咽癌和21鼻咽粘膜（伴慢性炎症）组织中的IGF-1R阳性表达率分别为82.5％和14.3％，在鼻咽癌中的表达阳性率明显高于鼻咽炎性组织(X2=32.45，P＜0.01)。鼻咽癌组织中IGF-IR的表达与TNM分期和颈淋巴结转移有关，有颈淋巴结转移者其表达阳性率较高;Ⅰ～Ⅱ期表达阳性率较Ⅲ～Ⅳ期低(P＜0.01);鼻咽癌局部复发者IGF-1R阳性表达率(89.5％)明显高于无局部复发者(53.9％，P＜0.05);鼻咽癌放疗后生存期小于5年者的阳性表达率(88.9％)明显高于5年以上生存期者的阳性表达率(51.9％，P＜0.01);病理分化程度越高IGF-1R阳性表达率越低，但鼻咽癌病理类型间比较差异无显著性(P＞0.05)。在三种鼻咽癌细胞系中IGF-1R的表达明显高于鼻咽炎症粘膜组织，其中TW03表达最强，CNE2其次，CNE1表达稍弱。 结论:鼻咽癌组织中存在IGF-1R的过表达现象，IGF-1R的异常表达与鼻咽癌的发生发展存在一定的关系，可考虑将其作为鼻咽癌早期诊断和判断预后的指标之一。IGF-1R可能是复发或转移性鼻咽癌治疗中一个潜在的靶分子。 第二部分 PKB/AKT和ERK/MAPK两条信号通路在鼻咽癌细胞中的活性表达和临床意义 IGF-1R已经被证实在细胞的生存、凋亡、增殖和分化中起着非常重要的作用，在某些恶性肿瘤组织中它能异常激活两条激酶系统如Akt/蛋白激酶B和细胞外信号调节激酶(MAPK)。 目的:探讨鼻咽癌细胞中PKB/AKT和ERK/MAPK信号转导通路异常激活与鼻咽癌细胞发生发展的关系。 方法:应用Western blots检测鼻咽癌组织和鼻咽炎性组织中IGF-1R、AKT和ERK1/2蛋白的表达情况;然后采用相同实验方法检测鼻咽癌细胞系CNE2中磷酸化的pAKT和pERK1/2蛋白的表达，以及给予胰岛素样生长因子-1刺激癌细胞后磷酸化的pAkt和pERK的表达水平，和同时用PKB/AKT、ERK/MAPK通路抑制剂Wortmannin、PD98059对鼻咽癌细胞PKB/AKT、ERK/MAPK信号转导通路磷酸化的调节。 结果:鼻咽癌细胞系CNE2中IGF-1R、Akt和Erk1/2蛋白水平明显高于鼻咽炎性组织;IGF-1可刺激鼻咽癌细胞系CNE2pAKT、pErk1/2的表达增加，与对照组相比，其pAkt和pErk表达明显增高;Wortmannin和PD98059能分别有效阻滞IGF-1对pAKT和pERK的激活。 结论:IGF-1R的过度表达和PKB/AKT和ERK/MAPK信号转导通路的异常激活与鼻咽癌的发生发展有密切的关系，而IGF-1R系统可能是复发或转移性鼻咽癌治疗中一个潜在的治疗靶分子。 第三部分 Picropodophyllin(PPP)靶向抑制鼻咽鳞癌细胞的胰岛素样生长因子-1受体的实验研究 目的：鼻咽癌(NPC)是在中国南方和东南亚地区最常见的头颈部恶性肿瘤。在癌症治疗方面，胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)已经表现出它是一种新的极有前景的治疗靶。IGF-1R在大部分恶性肿瘤组织中是过度表达的，并与预后不良有关，但其在鼻咽癌中的表达仍然不十分清楚。 方法:应用Western blots检测四个鼻咽癌细胞株(CNE1、CNE2、TW03以及TW03EB病毒(+))中IGF-1R蛋白表达、以及磷酸化pAKT和pERK1/2蛋白的表达情况;然后蛋白免疫沉淀技术检测四个鼻咽癌细胞株给予PPP治疗后IGF-1R磷酸化水平;最后采用XTT法检测四个鼻咽癌细胞株给予PPP治疗后的生长抑制。 结果:四个鼻咽癌细胞株IGF-1R蛋白表达不同，TW03表达最高，CNE2和CNE1次之，TW03EB病毒(+)表达最低;给予PPP治疗后，IGF-1R激活后的两条主要信号通路PI3K和MAPK中，PPP在CNE2、CNE1和TW03三个细胞株均能明显降低AKT磷酸化水平，它仅能稍微降低ERK1/2磷酸化水平;同时在上述三个细胞株中，PPP有效地阻止了磷酸化IGF-1R的活性，对高表达IGF-1R的细胞反应更快;此外，在体外培养的细胞株中明显表现出对癌细胞的生长抑制。PPP上述这些作用在TW03EB(+)细胞株表现非常弱。这些结果暗示EB病毒的感染促进了鼻咽癌细胞的肿瘤形成和降低抗癌治疗的效果。 结论:实验结果表明IGF-1R有可能成为一个极有前途的鼻咽癌治疗的靶分子。 第四部分 在肿瘤细胞中胰岛素样生长因子-Ⅰ受体的内化和泛素化分析 胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)已被证明在许多恶性肿瘤中呈高表达，在这些肿瘤的形成、生长、增殖、侵袭转移和拮抗细胞凋亡中起着关键作用，已被一些研究者作为一个极有前途的抗癌治疗的分子靶，然而对于正常细胞的生长并不是绝对需要IGF-1R，IGF-1R膜受体蛋白内化和泛素化降解已经引起研究者的重视。 目的:本研究的主要目的是探讨β-arrestin1分子在过度表达IGF-1R的肿瘤细胞中IGF-1R膜受体内化和泛素化降解的作用。 方法:我们采用免疫印迹法(Western Blots)、免疫沉淀技术(IP)技术对鼠胚胎成纤维瘤三种细胞株进行IGF-1R内化检测。 结果:在IGF-1R过度表达的P6细胞随配体刺激时间的增加内化IGF-1R明显增加，但非内化IGF-1R的水平明显降低;在β-arrestin1阴性细胞株随配体刺激时间的增加非内化IGF-1R的水平保持不变，而无IGF-1R内化产生，但阳性对照可以看到条带清晰的IGF-1R;同时检测在细胞通路中IGF-1R内化的作用在β-arrestin阴性细胞检测不到磷酸化的pERK。 结论:结果表明在β-arrestin1缺乏的情况下IGF-1R内化不能发生，β-arrestin1可作为一个调节IGF-1R内化的工具，也表明受体内化对细胞通路之一的MAPK是必需的。

目录

声明

英文缩略词表

摘要

前言

第一部分胰岛素样生长因子-1受体蛋白在鼻咽癌细胞中的表达及其临床意义

引言

1．材料和方法

2．结果

3．讨论

第二部分鼻咽癌细胞PI3K／AKT和ERK／MAPK两条信号通路的活性表达及其临床意义

前言

1．材料和方法

2．结果

3．讨论

第三部分Picropodophyllin(PPP)靶向抑制鼻咽鳞癌细胞的胰岛素样生长因子-1受体的实验研究

前言

1．材料和方法

2．结果

3．讨论

第四部分在肿瘤细胞中胰岛素样生长因子-1受体的内化和泛素化分析

1．对象和方法

2．结果

3．讨论

附图表

结论

参考文献

综述

攻读博士学位期间发表的论文

后记