整合H5N1禽流感病毒HA、NA蛋白的假型逆转录病毒构建及应用

摘要

目的： 据世界卫生组织(WHO)统计，截至2011年2月9日，全球累计报告H5N1型高致病性人禽流感病例520例，死亡307例，死亡率高达59.0％;国内报告H5N1型高致病性人禽流感病例40例，14例存活。目前虽然没有充分证据表明人与人之间可以相互传播，但H5N1禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)容易通过抗原漂移(antigen drift)或转移(antigen shift)发生变异，给H5N1禽流感疫苗的研发带来了极大挑战。如果出现禽流感病毒和人流感病毒基因重组株，并且新毒株获得人传人的能力，人类普遍对其缺乏有效免疫保护力，从而引发新的世界大流行。2006年我们通过使用恢复期血浆疗法成功治愈1例重症H5N1禽流感患者，从而开创了H5N1人禽流感被动免疫治疗的先河。人们在研究野生型H5N1禽流感病毒过程中，往往会面临危险性高、周期性长、试验条件苛刻等诸多难题，而假病毒(pseudotyped virus)技术的兴起为解决此类问题提供了一种非常有效的研究手段。因此，本研究首先通过分离深圳A/Shenzhen/406H/06病毒株，利用RT-PCR技术克隆HA、NA和NS基因，并对其基因特征、分子遗传进化特点进行深入分析;分别构建整合H5N1禽流感A/Shenzhen/406H/06和A/Thailand/KAN-1/04毒株HA、NA包膜蛋白的假型逆转录病毒，通过电镜、免疫印迹(Western-blot)技术对假病毒进行鉴定，建立基于假病毒技术的体外中和试验平台，为下一步人源单克隆中和抗体的筛选提供强有力的技术工具。 方法： 1.将从深圳H5N1禽流感患者气管分泌物中分离的病毒液经0.22μm滤膜过滤后，感染10cm培养皿中4×106个MDCK细胞，48h后收集细胞上清液，以20％蔗糖垫底70000×g超速离心3h进行病毒浓缩，使用Trizol试剂提取病毒RNA。异丙醇沉淀RNA后溶于15μL无RNA酶的灭菌水中，紫外分光光度仪测其浓度(A260)及纯度(A260/A280)。 2.根据A型流感病毒8个基因片段3'末端12个保守碱基序列设计反转录引物Uni12(5'-AGCAAAAGCAGG-3')，取1μL病毒RNA在Uni12和AMV反转录酶的作用下合成AIV基因组c-DNA文库。设计3对针对HA、NA和NS基因的特异性引物。取2μL反转录产物并分别使用HA、NA与NS基因的引物进行扩增，3个基因片段的反应条件均为:94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸2min，循环30次，最后72℃延伸7min。PCR产物用1％（W/V）琼脂糖凝胶电泳检测。 3.使用DNA琼脂糖凝胶纯化试剂盒回收PCR产物，在T4连接酶的作用下插入至pGEM-T Easy载体，连接产物直接用于转化JM109感受态细菌，通过蓝白斑筛选阳性克隆。将阳性克隆37℃过夜培养，小量抽提质粒并用NotⅠ酶切鉴定，之后送Invitrogen公司测序鉴定。 4.从GenBank中获取已公布的H5N1型HA、NA和NS基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列，应用Cluster及Mega3.1软件分析深圳人分离株H5N1AIV的HA、NA和NS基因序列特征及同源性，并绘制其系统发育进化树。 5.设计两端分别引入SalⅠ和BamHⅠ酶切位点扩增HA、NA基因的特异性引物，以pGEM-T-HA、pGEM-T-NA质粒作为模板进行PCR扩增，目的片段回收后使用SalⅠ和BamHⅠ进行双酶切，随后与同样酶切的CMV/R质粒进行连接，转化E.coliJM109感受态细菌后挑取阳性克隆转化子。 6.采用磷酸钙共沉淀法将pHR-Luc（14μg）、pCMV△8.2（14μg）、CMV/R-HA（2μg）、CMV/R-NA(0.5μg)共4种质粒转染至293T细胞。由于VSV-G蛋白具有广谱的宿主范围，所以用pHR-Luc、pCMV△8.2和pVSV-G三种质粒共转染作为阳性对照，另外以pHR-Luc和pCMV△8.2两种质粒共转染作为阴性对照。转染48h后取细胞上清，-80℃冻存备用。 7.将浓缩的H5N1禽流感假病毒粒子用含2％戊二醛的PBS进行固定，然后吸附在洁净的铜网中，2％磷钨酸钠(pH=6.5)进行负染色以进行电镜观察。同时取浓缩后的假病毒，按照文献介绍的Western-blot方法分析HA及P24的表达。其中HA一抗为H5N1AIV灭活株免疫鼠血清（1∶1000稀释），P24一抗为鼠抗P24多克隆抗体（1∶1000稀释）。两种蛋白的二抗均为碱性磷酸酶标记兔抗鼠IgG（1∶3000稀释）。 8.假病毒感染前24h在24孔板上分别接种2×104个MDCK细胞，分别以1000μL、200μL、40μL三个梯度的假病毒上清感染靶细胞，每个梯度设立3个复孔，并加入Polybrene(终浓度为8μg/mL)促进病毒粒子吸附，感染48h后按照检测感染细胞株中报告基因Luciferase的相对活性(relative luciferase activity，RLA)，从而间接判断假病毒的感染活性。 9.将MDCK细胞接种于24孔板，37℃，5％CO2培养过夜。使用PBS将每份恢复期血清从1∶10开始进行2倍梯度稀释，共12个梯度，然后分别按血清和病毒1∶1的体积比与200μL深圳株（或泰国株）假病毒混合，并以与40μVSV-G假病毒作为阴性对照，37℃孵育2h，然后将混合物加入到MDCK细胞中，37℃吸附2h后吸弃混合物，继续培养48h后测定RLA。以无血清阻断的细胞孔的RLA作为空白对照值，按照以下公式计算血清对假病毒的感染抑制率:感染抑制率=空白对照孔RLA-阻断孔RLA/空白对照孔RLA×100％ 结果： 1.H5N1AIV的RNA提取及其HA、NA和NS基因RT-PCR扩增:从H5N1AIV中提取的RNA经紫外分光光度仪测定A260为122.3μg/mL，A260/A280为1.82，表明RNA的浓度及纯度符合需求。以RNA为模板采用两步法RT-PCR扩增以上3个基因片段，经1％(W/V)琼脂糖凝胶电泳显示扩增片段大小分别约为1.7kb、1.4kb和800bp，与预期大小相符。 2.AIV的HA、NA和NS基因克隆与鉴定:PCR产物纯化后按照常规方法与pGEM-T Easy载体进行连接、转化，用NotⅠ（目的片段克隆位点两侧均有NotⅠ酶切位点）酶切鉴定，结果分别出现与pGEM-T Easy载体(3.0kb)和预期扩增的片段大小相等的条带。将该病毒株3个基因片段的重组质粒送Invitrogen公司测序鉴定，毒株命名为A/Shenzhen/406H/06，并已经登录至GenBank，HA、NA、NS基因的编号分别为EF137706、EF137708、EF137710。 3.H5N1AIV的HA、NA、NS基因序列特征:HA基因编码567aa，HA蛋白裂解位点的氨基酸组成为SPLRERRRKR↓GLF。与其它病毒株HA蛋白序列相比较，该毒株在受体结合位点Tyr91、Trp149、Ile151、His179、Asn182、Leu190、Gln192以及130～134(GVSSA)和220～224(NGQSG)等位点相当保守。HA蛋白中保留了传统的7个糖基化位点，另外出现Ala156Thr突变，从而在Asn154增加了一个潜在糖基化位点。NA基因编码449aa，其一级结构包括氨基端胞浆尾、非极性跨膜区、茎部和头部共4个结构域。与H1N1AIV进行比对，发现A/Shenzhen/406H/06在49～68位缺失20个氨基酸，从而导致NA茎部丢失4个潜在糖基化位点(NQS、NNT、NQT、NIS)。NS基因含有2个开放读码框，编码NS1和NS2蛋白。NS1由225aa组成，与A/Hongkong/156/97进行比对发现在80～84位发生氨基酸缺失。 4.H5N1AIV的HA、NA、NS基因系统进化树的绘制:依据HA基因AIV可分为两大谱系:北美谱系与欧亚谱系，其中欧亚谱系大致分为4个分枝，即中国内地分枝、青海分枝、02/03香港分枝和97香港分枝。A/Shenzhen/406H/06位于欧亚谱系中国内地分枝上。NA基因分为三大谱系，即经典猪源谱系、人源谱系、禽源谱系。A/Shenzhen/406H/06属于禽源谱系。NS基因可分为等位基因A群和B群。A/Shenzhen/406H/06属于等位基因B群，与A/Dk/Fujian/1734/05和A/Dk/Hunan/191/05处于同一进化分枝上，其核苷酸同源性分别为98.3％和94.8％。 5.CMV/R-HA、CMV/R-NA表达载体的构建及鉴定:以pGEM-T-HA、NA载体为模板进行PCR扩增，同时在扩增片段两端分别引入SalⅠ和BamHⅠ酶切位点，扩增片段大小与预期大小相符。扩增片段与CMV/R载体连接后，经过酶切鉴定产生与CMV/R空载体(4.0Kb)和目的片段大小一致的条带，从而证明HA、NA基因成功克隆至CMV/R载体。 6.H5N1禽流感假病毒的电镜观察:由于假病毒系统是由慢病毒载体构建而来，其衣壳蛋白来源于HIV-1的gag，而包膜蛋白则由HA、NA代替gp120，因此其病毒粒子直径应该与HIV-1相近，约100nm。另外假病毒粒子分布于病毒出芽、释放等各个阶段，与野生型病毒的生活周期非常相似。 7.H5N1禽流感假病毒HA、P24蛋白Western-blot鉴定:将裂解后的假病毒用H5N1AIV灭活株免疫鼠血清进行孵育，在深圳株、泰国株假病毒泳道中出现3条条带，自上而下分子量约为80×103、55×103和25×103，分别与HA前体蛋白HA0、HA0裂解后形成的HA1和HA2蛋白大小相符，提示假病毒表面整合了H5N1AIV HA蛋白，而对于仅转染pHR-Luc和pCMV△8.2两种质粒的阴性对照则未出现HA条带。而将裂解病毒与鼠抗P24多克隆抗体分别进行孵育，则深圳株、泰国株假病毒以及阴性对照均出现P55、P41和P24共3条条带，提示三种细胞上清中均存在HIV病毒样粒子(virus-like particle,VLP)。 8.H5N1禽流感假病毒的感染活性:深圳株、泰国株假病毒均具有感染活性，效价略低于作为阳性对照的整合VSV-G蛋白的假病毒，200μL假病毒上清感染MDCK细胞后RLA值约为2×104，明显高于仅转染pHR-Luc和pCMV△8.2两种质粒的阴性对照（未整合HA、NA蛋白的HIV病毒样粒子）。 9.基于假病毒技术体外中和试验平台的建立:将12个梯度稀释的深圳和安徽血清分别与深圳株、泰国株假病毒进行中和反应，并以VSV-G假病毒作为阴性对照，深圳恢复期血清对自身分离的深圳株假病毒RLA值的50％抑制浓度(IC50)约为1∶10240，而对泰国株假病毒中和效价显著低于深圳株，IC50介于1∶160～320，而对VSV-G假病毒基本无中和能力。安徽恢复期血清对深圳株假病毒的中和效价高于泰国株，其中对深圳株假病毒的IC50介于1∶5120～10240，低于深圳患者自身恢复期血清的中和能力(1∶10240);而对泰国株假病毒的IC50介于1∶2650～5120，则显著高于深圳恢复期血清。 结论： 1.A/Shenzhen/406H/06HA蛋白裂解位点含有多个连续的碱性氨基酸，具备高致病性毒株的基因特征，另外Ala156Thr突变导致在Asn154增加一个潜在糖基化位点，可能是影响AIV毒力的另一重要因素。NA蛋白茎部缺失49～68aa可以导致H5N1AIV的毒力下降，NS1蛋白80～84aa缺失可导致H5N1AIV抗干扰素能力下降，但HA156位新增的潜在糖基化位点将弥补以上缺失所致的负面作用，从而使其复制

目录

声明

摘要

引言

1．H5N1 AIV流行病学特点

2．H5N1 AIV分子生物学特征

3．H5N1 AIV跨种属感染人的机制研究

4．抗H5N1 AIV药物研究概况

5．H5N1 AⅣ疫苗研究进展

第一部分深圳人H5N1禽流感病毒分离株A／shenzhen／406H／06基因特征及其遗传进化分析

材料与方法

结果

讨论

第二部分基于假病毒技术的H5N1禽流感体外中和试验平台的建立及评价

材料与方法

结果

讨论

参考文献

综述

攻博期间发表学术论文

致谢