组合代谢途径扩展脂肪酸酯的生物合成

摘要

由于人类对清洁能源需求的不断增加，生物柴油作为一种可再生燃料越来越受到人们的关注。生物柴油是定义为脂肪酸酯的一类物质，其通常以植物油脂和醇为原料，利用化学催化剂或酶催化底物发生转酯化反应而制备获得。甲醇的价格相对于其他醇更为廉价，为此目前市场上的生物柴油分子为脂肪酸甲酯。然而，植物油脂总量有限且价格逐年上升阻碍了生物柴油的大规模发展，为实现生物柴油更大规模的生产，我们有必要开发新的方法，利用更为廉价的原材料如纤维素或葡萄糖等来合成生物柴油。另一方面，当前的生物柴油分子低温流动性能不佳阻碍了其在冬天的使用，为此我们有必要开发性能更佳的生物柴油分子。 2006年Steinbuchel课题组首次报道了利用遗传改造的大肠杆菌直接发酵单糖合成脂肪酸乙酯，即微生物柴油。该方法基于Acinetobacter baylyi菌中新发现的一个蜡酯/脂肪酰辅酶A:二酰甘油酰基转移酶(WS/DGAT)，该酶可催化乙醇和脂肪酰辅酶A发生酯化反应合成脂肪酸乙酯。基于上述研究，我们可以考虑利用其他醇替代乙醇，以便合成各种脂肪酸酯，扩充生物柴油分子种类。多种短链醇，包括丙醇、丁醇、异丁醇、2-甲基丁醇或3-甲基丁醇等可经遗传改造微生物生物合成，为此我们推测可在上述合成短链醇的微生物中通过外源表达ws/dgat基因催化短链醇与脂肪酰辅酶A酯化合成各种脂肪酸短链酯。 本研究首次开展了遗传改造大肠杆菌联合2-酮酸和脂肪酸代谢途径合成各种脂肪酸短链酯。作者通过表达来自酿酒酵母的aro10(2-酮酸脱羧酶)和adh2（醇还原酶）基因生产短链醇，随后通过表达ws/dgat基因催化短链醇和脂肪酰辅酶A酯化生成各种脂肪酸短链酯。进一步通过表达tesA'和adD基因及敲除fadE基因加强胞内脂肪酰辅酶A的积累以促进脂肪酸短链酯的生物合成。为考察发酵放大条件下脂肪酸短链酯的合成情况，我们选取TL101/pDG102/pMSD15菌株开展了一个补料罐体发酵实验，脂肪酸短链酯的产量达到了1008mg/L。 生物柴油较高的晶体析出温度阻碍了其广泛应用。由于较高的晶体析出温度，生物柴油在冬天使用时，容易析出晶体，堵塞油管和滤膜，影响正常使用。晶体的形成涉及到分子的有序组装。在长链的分子内部引入侧链，可降低分子间的有序性，导致分子与分子间的范德华力减弱，从而降低分子的晶体析出温度。为此通过在生物柴油分子内部引入侧链，形成脂肪酸支链酯，可有效的降低该分子的晶体析出温度，改进其低温流动性能，扩大生物柴油的使用范围。 本研究首次开展了联合支链氨基酸（缬氨酸和亮氨酸）和脂肪酸代谢途径生物合成脂肪酸异丁酯和脂肪酸异戊酯。作者通过表达alsS、ilvC、ilvD、aro10和adh2基因，转化丙酮酸为异丁醇和异戊醇;随后作者通过表达ws/dgat催化异丁醇和异戊醇与脂酰辅酶A酯化生成脂肪酸异丁酯和脂肪酸异戊酯。另一方面，作者首次开展了联合丙酮和脂肪酸代谢途径生物合成脂肪酸异丙酯。通过表达atoB、atoAD、adc和adh基因，转化乙酰辅酶A合成异丙醇;随后通过表达ws/dgat基因催化异丙醇与脂酰辅酶A酯化生成脂肪酸异丙酯。最后通过表达tesA'和fadD基因及敲除adE基因，进一步加强了胞内脂肪酸支链酯的合成。 在成功的展示了整合支链醇合成脂肪酸支链酯后，作者进一步设计了一个合成支链脂肪酸的代谢途径。本研究通过外源表达枯草芽孢杆菌fabHB和bckd基因，使大肠杆菌成功实现了支链脂肪酸的生物合成。为检测是否可进一步将支链脂肪酸转化为支链脂肪酸短链酯，作者在大肠杆菌中同时导入了合成支链脂肪酸和脂肪酸支链酯两个代谢途径。上述两个途径的结合成功实现了支链脂肪酸短链酯生物合成。 在大肠杆菌中成功展示了多种脂肪酸酯的生物合成后，作者希望能进一步在酵母细胞中建立脂肪酸酯的合成。酿酒酵母是一个非常好的产乙醇工业菌株，该菌株具有遗传操作技术成熟、生长繁殖速度快、营养需求简单、细胞壁厚抗逆性强、不受噬菌体污染等优点，为此遗传改造酿酒酵母生物合成脂肪酸乙酯，具有较好的优势。本研究通过在酿酒酵母中外源表达ws/dgat基因，使该菌株成功的展示了合成脂肪酸乙酯的能力，摇瓶发酵产量为6.7mg/L。随后作者通过高表达acc1基因加强丙二酰辅酶A的供给，使脂肪酸乙酯产量增加65％，达到11.1mg/L。作者进一步敲除pox1基因中断脂酰辅酶A的降解，使脂肪酸乙酯的产量再次增加45％，达到到15.9mg/L。然而与经过类似遗传改造的重组大肠杆菌比较，酿酒酵母脂肪酸乙酯的产量并不理想。 毕赤酵母具有高效的外源蛋白表达能力，为此我们希望能最终在毕赤酵母中实现脂肪酸酯的高效生物合成。考虑到2-酮酸和脂肪酸代谢途径是各种微生物体内的天然代谢途径，该策略可进一步应用到毕赤酵母中。本研究通过在毕赤酵母中外源表达aro10、adh2和ws/dgat三个基因，使该菌株成功的实现了脂肪酸短链酯的高效生物合成，摇瓶发酵下产量达到201.5mg/L。

目录

声明

摘要

一绪论

1．1可再生能源

1．1．1定义与分类

1．1．2可再生能源发展趋势

1．1．3生物质能源

1．2生物柴油

1．2．1概述

1．2．2转酯化法体外合成生物柴油

1．2．3微生物发酵直接合成生物柴油

1．3脂肪酸合成

1．3．1大肠杆菌脂肪酸合成

1．3．2酿酒酵母脂肪酸合成

1．4短链醇生物合成

1．4．1氨基酸途径合成异丁醇

1．4．2梭菌途径合成丁醇和异丙醇

1．5本研究的目的与意义

二、实验材料和方法

2．1实验材料

2．1．1实验菌株、质粒

2．1．2酶试剂和生化试剂

2．1．3溶液和培养基配制

2．2实验方法

2．2．1保藏菌活化

2．2．2质粒DNA提取

2．2．3质粒DNA检测

2．2．4目的基因片段PCR扩增

2．2．5 PCR产物的切胶回收

2．2．6 DNA酶切

2．2．7 PCR产物试剂盒纯化

2．2．8酶连

2．2．9 CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞

2．2．10质粒DNA对大肠杆菌感受态细胞的转化

2．2．11大肠杆菌质粒DNA快速检测

2．2．12菌种保藏

2．2．13酵母基因组DNA提取

2．2．14酵母细胞感受态细胞制备

2．2．15酿酒酵母细胞质粒转化

2．2．16酿酒酵母基因敲除

2．2．17大肠杆菌合成各种脂肪酸酯发酵

2．2．18酿酒酵母合成脂肪酸乙酯或脂肪酸甲酯发酵

2．2．19毕赤酵母合成脂肪酸短链酯发酵

2．2．20产物提取

2．2．21脂肪酸酯标准品合成

2．2．22各种脂肪酸酯产物的检测

2．2．23短链醇的检测

三、遗传改造大肠杆菌合成脂肪酸短链酯

3．1引言

3．2质粒构建

3．2．1大肠杆菌合成脂肪酸短链酯相关质粒构建

3．3结果与分析

3．3．1构建大肠杆菌合成脂肪酸短链酯基本代谢途径

3．3．2敲除fadE基因促进重组大肠杆菌脂肪酸短链酯合成

3．3．3高表达tesA’基因促进大肠杆菌脂肪酸短链酯合成

3．3．4高表达fadD基因促进大肠杆菌脂肪酸短链酯合成

3．3．5补料发酵

3．4讨论与总结

四、遗传改造大肠杆菌合成脂肪酸支链酯

4．1引言

4．2质粒构建

4．2．1大肠杆菌合成脂肪酸异丁酯和异戊酯质粒构建

4．2．2大肠杆菌合成脂肪酸异丙酯质粒构建

4．2．3大肠杆菌合成支链脂肪酸短链酯质粒构建

4．3结果与分析

4．3．1构建合成脂肪酸异丁酯及异戊酯的基本代谢途径

4．3．2增加胞内脂酰辅酶A的积累加强脂肪酸支链酯合成

4．3．3构建合成脂肪酸异丙酯基本代谢途径

4．3．4增加胞内脂酰辅酶A的积累加强脂肪酸异丙酯合成

4．3．5构建合成支链脂肪酸短链酯的代谢途径

4．4讨论与总结

五．遗传改造酿酒酵母合成脂肪酸乙酯

5．1引言

5．2质粒构建及基因敲除

5．2．1酿酒酵母合成脂肪酸乙酯相关质粒的构建

5．2．2 pox1基因敲除

5．3结果与分析

5．3．1酿酒酵母中表达ws／dgat基因合成脂肪酸乙酯

5．3．3敲除pox1基因对脂肪酸乙酯合成的影响

5．4讨论与总结

六、遗传改造毕赤酵母合成脂肪酸短链酯

6．1引言

6．2毕赤酵母合成脂肪酸短链酯相关质粒的构建

6．3结果与分析

6．4讨论与总结

七、研究总结与展望

7．1总结

7．2展望

参考文献

攻读博士期间发表的与学位论文相关的科研成果目录

致谢

附录