Smac基因过表达联合天花粉蛋白对Caski细胞凋亡的影响及其相关机制的研究

摘要

目的：本研究主要探讨Smac基因过表达联合天花粉蛋白(TCS)处理对人宫颈癌Caski细胞凋亡的影响及其相关机制。
　　方法：Western blot法鉴定TCS对人宫颈癌Caski细胞Smac蛋白水平表达的影响；构建真核表达质粒 pcDNA3.1(-)/Smac,将该质粒稳定转染入宫颈癌 Caski 细胞后,RT-PCT和Western blot法分别在mRNA和蛋白水平上的鉴定筛选得到的Smac高表达的细胞Caski/Smac；MTT法观察Smac高表达对Caski细胞生长及对TCS敏感性的影响；流式细胞仪分析 TCS对 Caski细胞凋亡的影响；Western blot 法分析 TCS对Caski细胞凋亡相关因子cyt-c的表达影响。
　　结果：①TCS能诱导Caski细胞内Smac基因表达,且呈时间与浓度依耐性；②成功获得Smac基因高表达的细胞株Caski/Smac；③Smac高表达使Caski细胞生长速度明显减慢(P<0.01),且对TCS的敏感性显著性增加(P<0.01)；④TCS作用于Caski细胞可诱发其凋亡,但Smac高表达的细胞凋亡更为明显,差异具有显著性(P<0. 01)。
　　结论：Smac基因过表达能增加Caski细胞对TCS的敏感性,在同等药物浓度下能更明显抑制细胞增殖和促进其凋亡。此外,TCS也能够诱导细胞中Smac基因表达,这可能是其促细胞凋亡的机制之一。

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英文缩略词表

引言

材料与方法

1.1 仪器和设备

1.1.1实验材料和试剂

1.1.2实验试剂的配制

1.2 实验方法

1.2.1细胞传代培养

1.2.2感受态细胞的制备

1.2.3质粒的转化

1.2.4考马斯亮蓝法测定蛋白浓度

1.2.5 Western blot鉴定TCS对宫颈癌Caski细胞Smac基因蛋白水平表达的影响

1.2.6 TRIzol法提取细胞总RNA

1.2.7 RT-PCR克隆人Smac的cDNA

1.2.8 细胞冻存

1.2.9 真核表达质粒pcDNA3.1(-)/Smac的构建及鉴定

1.2.10 高表达Smac基因的宫颈癌Caski细胞株的构建

1.2.11 RT-PCR法鉴定克隆细胞中Smac mRNA的表达水平

1.2.12 Western印迹法筛选阳性克隆细胞

1.2.13 MTT法检测稳转细胞株Caski/Smac细胞的生长特性

1.2.14 MTT法检测TCS对Caski/Smac细胞的增殖影响

1.2.15 流式细胞术检测细胞凋亡

1.2.16 Western blot分析不同浓度TCS处理Caski/Smac后凋亡调控相关因子cyt-c蛋白表达影响

1.2.17 统计学方法

结果

第一部分：分析TCS对宫颈癌Caski细胞中Smac基因表达的影响

第二部分：高表达Smac基因的宫颈癌Caski细胞株的构建及鉴定

第三部分：Smac基因高表达联合TCS对宫颈癌Caski细胞增殖及凋亡的影响

讨论

小结

参考文献

综述

致谢