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dHira基因过量表达对果蝇早期胚胎发育的影响

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引言

1.文献综述

1.1果蝇的个体发育过程

1.1.1果蝇的胚胎发生

1.1.2幼虫的发育

1.1.3蛹和成虫

1.2 Hira基因的研究现状

1.2.1 HIRA的结构及不同结构域的功能

1.2.2酵母Hir基因的研究概况

1.2.3无脊椎动物Hira基因的研究概况

1.2.4脊椎动物Hira基因的研究概况

1.3 Hira基因的功能和作用机理

1.4 P因子及UAS-Gal4系统简介

1.4.1转座因子及P因子简介

1.4.2功能获得性突变的介绍

1.4.3 UAS-Gal4系统简介

1.5本研究的目的和意义

2.材料和方法

2.1实验动物

2.2主要仪器设备

2.3试剂盒、主要试剂、质粒

2.4实验方法

2.4.1果蝇饲料的配制

2.4.2质粒构建

2.4.3果蝇胚胎的收集

2.4.4显微注射及转基因果蝇的检测

2.4.5 Western分析

2.4.6 dHira过量表达导致果蝇早期胚胎死亡率的统计

2.4.7果蝇胚胎的荧光染色

2.4.8 RNA的提取

2.4.9 RT-PCR检测

2.4.10数据分析

3.实验结果

3.1转基因果蝇的获得

3.2 Western分析证实dHira基因在胚胎早期过量表达

3.3在母型驱动子控制下过量表达dHira对果蝇胚胎发育的影响

3.4 dHira过量表达对果蝇早期胚胎核分裂的影响

3.5 dHira过量表达对组蛋白基因表达的影响

3.6 dHira过量表达对细胞周期、细胞衰老凋亡相关基因的影响

4.讨论

4.1 UAS-Gal4系统在本研究中的效果

4.2 Hira基因对动物胚胎发育的影响

4.3 dHira过量表达导致果蝇早期胚胎核分裂不正常

4.4 dHira过量表达对果蝇早期胚胎影响的机理探讨

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摘要

果蝇(Drosophila melanogaster)由于具有容易饲养、产卵多、生命周期短以及具有粗大的多线染色体而便于进行基因定位等优点,已成为遗传学和发育生物学等研究领域中重要的模式生物之一,对现代生命科学的发展作出了突出的贡献。果蝇的基因组测序已经完成。在对果蝇与人类基因的比较中,发现三分之二引发人类疾病的基因(包括与癌症有关的基因)在果蝇中都存在有类似的基因。 Hir/Hira(histone regulation,组蛋白调节基因)最先作为组蛋白基因表达的一种负调节因子从酵母中被鉴定出来,现已证实,其产物HIR/HIRA是组蛋白的伴侣蛋白,包含一组保守的蛋白家族,广泛存在于低等真核生物、无脊椎动物和脊椎动物等多种生物体当中。HIRA家族最明显的特点是,N端都有7个WD40区,推测借此形成β-螺旋结构和两个潜在的核定位信号区。HIRA可通过其不同的结构域与不同的蛋白质相互作用,来参与调节核小体的组装、染色质的结构及细胞周期的进程等。其N端能够和其他的组蛋白伴侣如ASF1和CAF-1相互作用,对组蛋白基因的转录和异染色质的沉默起调节作用。N端还可能通过上调一组与细胞周期相关的基因来促进细胞生长。C端负责与成对的同源异型域、Hir互作蛋白3(Hirip3)以及核心组蛋白的生化互作。HIRA在从酵母到人类的长期进化过程中高度保守,说明其在生命发育过程中起着重要作用。mHira基因敲除的小鼠胚胎表现出复杂的表型缺陷,原条扭曲,脊索和神经管发育异常,发育至孕中期时全部死亡。Kirov等和LAevadot等先后在无脊椎动物果蝇中发现了Hira家族的成员dHira。Northern分析表明,在雌性成体、未受精卵和0-3时龄的胚胎中,dHira的转录本很高,之后急剧下降,说明它们在早期胚胎发育过程中可能起了重要的作用,但其具体功能还未见报道。 本研究将果蝇Hira基因(dHira)的cDNA克隆到载体UASp中,运用UAS-Gal4系统,通过功能获得性突变的方法使dHira在果蝇早期胚胎中大量表达,来研究Hira在无脊椎动物果蝇中的作用。结果发现在胚胎发育早期,无论是在头部还是在全胚胎过量表达dHira,都引起果蝇胚胎大量死亡,死亡率明显高于对照组,而且随着转基因拷贝数的增加,胚胎的死亡率也显著增加,说明dHira过量表达对果蝇胚胎发育产生严重影响。对果蝇早期胚胎进行荧光染色,结果显示,dHira过量表达导致果蝇早期胚胎的细胞核分裂不正常,合胞体胚盘内染色体数目明显少于野生型的,而且核处于不同的分裂期,说明其细胞核分裂不同步,而且有核解体的迹象。推测HIRA可能影响了染色体的结构和组装,从而影响了细胞周期的进程,导致果蝇早期胚胎细胞核分裂异不正常。又采用RT-PCR的方法,分析了组蛋白基因及细胞周期、细胞衰老凋亡相关基因的表达量的变化。结果显示,dHira过量表达后,核心组蛋白基因H2A、H2B、H3和H4的表达量没有明显变化,而CycA、CycE、cdc25和debcl等与细胞周期、细胞凋亡相关基因的表达量都有所上升,尤其是CycA,上调最明显。这些结果表明,dHira过量表达,可能干扰了与细胞周期、细胞凋亡等相关基因的正常表达,从而影响了果蝇早期胚胎快速、同步的核分裂,导致早期胚胎的大量死亡。

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