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【6h】

中华卵索线虫tra-1基因的克隆及表达分析

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文摘

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声明

1前言

1.1哺乳类的性别决定及分化研究进展

1.2果蝇的性别决定及分化机制

1.3秀丽隐杆线虫性别决定与分化机制

1.4线虫性别决定及分化机制研究进展

1.5 tra-1基因与线虫的性别决定与分化

1.6实验中相关技术简介

1.6.1 RACE技术简介

1.6.2实时荧光定量PCR技术

1.7立题背景与意义

2材料与方法

2.1材料

2.1.1材料来源

2.1.2饲料配方

2.1.3主要试剂

2.1.4主要仪器设备

2.2方法

2.2.1材料收集

2.2.2各时期线虫总RNA的提取

2.2.3巢式PCR扩增tra-1基因cDNA片段

2.2.4 RACE

2.2.5 tra-1基因在中华卵索线虫各发育时期的表达分析

3结果与分析

3.1总RNA提取及质量评估

3.2 tra-1基因锌指结构区域cDNA片段的扩增

3.3 RACE结果及序列分析

3.4中华卵索线虫tra-1基因同源性分析

3.5中华卵索线虫发育不同时期tra-1基因表达情况分析

3.5.1中华卵索线虫tra-1和18S rRNA基因cDNA片段PCR

3.5.2 18S rRNA基因和tra-1基因标准曲线

3.5.3寄生密度对中华卵索线虫tra-1基因表达量影响研究

3.5.4 tra-1基因在中华卵索线虫不同发育时期的表达特征

4讨论

4.1 tra-1基因结构及保守性分析

4.2 tra-1基因在中华卵索线虫各时期表达分析

4.2.1中华卵索线虫中tra-1基因与雌性生殖系统发育有关

4.2.2tra-1基因功能在中华卵索线虫与秀丽隐杆线虫具有保守性

4.2.3寄生期营养条件对tra-1基因表达影响

4.3实验方法

4.3.1中华卵索线虫tra-1 cDNA全长的克隆

4.3.2关于实时荧光定量PCR

4.4小结与展望

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文

致谢

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摘要

中华卵索线虫(Ovomermis sinensis)是一种昆虫病原线虫,其性别分化决定于寄生期的营养竞争压力(环境决定型),目前有关此类线虫性别决定及分化的分子机制还不清楚。 为了探明中华卵索线虫性别决定及分化的机制,在参考国内外其它线虫等相关研究文献资料基础上,首次从该线虫中克隆到了性别决定基因tra-1 cDNA片段,并通过实时荧光定量PCR对其在中华卵索线虫发育各期中的表达情况进行了研究。 主要的研究结果如下: (1)利用RT-PCR和3'RACE技术从中华卵索线虫中克隆了tra-1 基因3’端cDNA部分序列。该序列总长度为800bp,编码一个包含195个氨基酸残基的多肽,用SMART软件对其蛋白质二级结构进行预测,结果显示该多肽含有3个连续的C2H2型锌指;同源性分析表明,本实验所获得的中华卵索线虫tra-1基因氨基酸序列与人的GL13、果蝇CiD结构域、C.elegans TRA-1A、C.briggase TRA-1A及Ppa-TRA-1在锌指结构区域具有较高的同源性,相似性分别为:70%、71%、73%、77%、71%,而在此区域外相似性仅为6%。从而说明中华卵索线虫tra-1基因编码的蛋白质亦属于GLI转录因子家族,且仅在锌指区域具有很高的保守性。 (2)通过实时荧光定量PCR检测了tra-1基因在中华卵索线虫胚胎、感染期幼虫、A组(感染比例为1:40)寄生1、2、3、4、5、6天幼线虫、B组(感染比例为1:10)寄生1、2、3、4、5、6天幼线虫、寄生后期雌幼线虫、寄生后期雄幼线虫、蜕皮后雌成虫、蜕皮后雄成虫和怀卵雌虫中的表达。结果显示,蜕皮后雌成虫tra-1相对表达量最高,且与其它时期的差异极其显著(P<0.01);到怀卵雌虫与受精卵中tra-1相对表达量显著下降,但仍显著高于其它实验组(P<0.05);其它实验组包括感染期幼虫、寄生各期幼虫(寄生1、2、3、4、5、6天)、寄生后期雌雄虫及雄成虫之间表达无明显差异(P>0.05).结合形态学研究结果比较分析表明,在性腺分化的关键时期,tra-1基因的高水平表达促使性腺分化为雌性生殖腺,低水平表达促使其分化为雄性生殖腺,即在中华卵索线虫,TRA-1A参与调控生殖腺的发育与分化;由定量结果,推测TRA-1A参与调控该线虫卵的形成和胚胎发育。 以上研究得出,IRA-1A在中华卵索线虫中的功能与其在其它自由生活的线虫中的功能是一致的,从而说明TRA-1A在功能上具有一定的保守性。通过以上对中华卵索线虫tra-1 cDNA序列及表达模式研究表明,tra-1基因在结构上及功能上具有很大的保守性,从而暗示了在寄生生活的线虫有可能存在与自由生活的线虫相似的性别决定与分化的信号级联通路,为进一步揭示营养决定分化机制打开一个突破口。

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