两个油菜NAC基因的鉴定及其表达和功能的初步研究

摘要

油菜（Brassica napus）属于十字花科，是一种重要的油料作物。油菜籽是我国对外贸易中的大型农产品之一。因此，研究油菜在胁迫环境中的表达情况及分子调控机制，对于提高油菜产量具有十分重要意义。NAC转录因子是近十几年来发现的一类植物特有的转录因子，迄今为止，在其他真核生物中还未发现同源物，其主要特征是含有一个十分保守的DNA结合部位的N端部分和一个高度变异且具有转录激活功能的C端部分。N端部分又可以划分为五个子结构域(A，B，C，D，E)，其中A、C、D高度保守，B和E保守性不强。NAC转录因子不仅在植物生长发育和器官建成过程中有重要的影响，而且在激素调节和防御抵抗多种生物和非生物胁迫等方面发挥着重要作用。本文从油菜中克隆鉴定了两个NAC基因，分别命名为BnNAC2和BnNAC5，并对这两个基因的表达及功能进行了研究探讨，取得如下主要结果：
　　 1.油菜BnNAC2和BnNACS基因在NaCl，Mannitol，ABA胁迫处理下的诱导表达
　　 为了研究油菜中的NAC基因，我们通过生物信息学的方法，找到了六个油菜的NAC基因，并命名为BnNACl-6。首先通过实时定量RT-PCR分析了这六个基因在盐胁迫、干旱，ABA胁迫下的表达模式，结果表明，BnNAC2和BnNAC5这两个基因在一定时间范围内的表达受到盐，甘露醇（模拟干旱）以及ABA的诱导较显著。这些结果说明BnNAC2和BnNAC5可能参与植物体对盐、干旱和ABA的胁迫应答，同时也间接说明干旱和高盐胁迫信号以及干旱与ABA信号通路之间可能存在着交叉。
　　 2.油菜BnNAC2和BnNAC5基因的分离鉴定
　　 从油菜cDNA中分离克隆了这两个2个油菜NAC基因：BnNAC2和BnNAC5。其后，用PCR的方法从油菜基因组中分离了BnNAC2和BnNAC5基因的DNA全长序列，通过全长分析发现均含有3个外显子和2个内含子。对同类NAC蛋白的比较分析表明，BnNAC2/5基因的编码蛋白的N端非常保守，并可以分为五个亚结构域，而C端则表现为高度多样性。
　　 3.油菜BnNAC2和BnNAC5基因在不同组织中的表达模式
　　 提取油菜不同组织的总RNA，逆转录成cDNA。利用实时定量RT-PCR技术分别对BnNAC2和BnNAC5基因的表达情况进行分析，结果显示BnNAC2/5在各个组织中均有表达，BnNAC2在花组织中表达量最高，BnNAC5在茎中表达量最高。同时我们分离了BnNAC2基因的启动子，构建了BnNAC2promoter::GUS融合表达载体，采用农杆菌介导的方法转化拟南芥，利用GUS组织化学分析技术研究BnNAC2启动子在转基因拟南芥中的活性，发现其表达模式与RT-PCR结果一致。总的来说，以上结果表明这两个基因可能在油菜的不同组织器官发育中发挥作用。
　　 4.油菜BnNAC2和BnNAC5蛋白的转录激活分析
　　 将油菜BnNAC2和BnNAC5基因构建到PGBKT7载体中，分别转化酵母菌株AH109和Y187，分析其转录自激活活性。结果表明，BnNAC2蛋白具有转录激活功能，而BnNAC5不具备转录激活功能，推测BnNAC5可能在细胞内发挥转录抑制作用。
　　 5.在转裂殖酵母中过量表达BnNAC2和BnNACS基因增强了细胞对盐和干旱的敏感性
　　 将BnNAC2和BnNAC5基因构建在PREP5N载体上，导入裂殖酵母，进行这两个基因的过量表达分析。通过在不同的培养基上培养转化细胞，观察其生长状态，结果表明，诱导BnNAC2和BnNAC5基因的表达将会导致酵母细胞生长变缓慢，而在NaCl和Mannitol处理下，过量表达BnNAC2和BnNAC5的酵母细胞生长更加缓慢。另外，我们对过量表达BnNAC2,BnNAC5这两个基因的酵母的形态进行分析，通过显微镜观察以及测量长度，结果表明过量表达BnNAC2的酵母长度显著增长，而过量表达BnNAC5的酵母长度与对照相比无明显区别。采用DAPI染色后，发现增长的酵母中核与对照组无明显区别，说明在酵母中过量表达BnNAC2会导致细胞增长。