海洋放线菌基因组文库的构建和功能基因的克隆及序列分析

摘要

以稀有海洋放线菌Salinispora arenicola和Streptomyces sp.为实验材料,随机机械剪切提取的总DNA,5’-磷酸末端补平回收40kb左右的DNA片段,与pWEBTM载体连接,经包装蛋白包装成噬菌体后侵染宿主细胞E.coli EPI100,构建该菌株的基因组文库,并对该文库进行质量鉴定。稀有海洋放线菌Salinispora arenicola的基因组文库的效价达6.5×104CFU／mL,得到3,000个阳性克隆子,远远大于按覆盖率为99.9％计算至少所需的1380个阳性克隆子数,且平均插入片段长度为36kb,重组率接近100％。成功构建的稀有海洋放线菌Streptomyces sp.的基因组文库,效价达9.0×104CFU／mL,得到4000个阳性克隆子,远远大于按覆盖率为99％计算至少所需的837个阳性克隆子数,且平均插入片段长度为36kb,重组率同样接近100％。阳性克隆子保存于96孔板中,-80℃保存。所构建文库的各项指标均达到要求,为了进一步评估Salinispora arenicola和Streptomyces sp.所能合成的所有潜在天然产物,还需要进一步检测该文库中包含有生物合成基因簇的大肠杆菌的表达情况。
　　 实验后期成功克隆了稀有海洋放线菌Salinispora arenicola的非核糖体肽合成酶(NRPS)和卤化酶生物合成基因簇核心区基因片段。根据已发表的放线菌NRPS和卤化酶生物合成基因簇核心区的核苷酸序列保守区设计两对简并性引物,采用PCR的方法扩增NRPS和卤化酶生物合成基因簇核心区基因片段,并使用分子生物学软件进行了序列分析。所获得的两段基因片段大小分别为660 bp和555 bp,分别编码220个和185个氨基酸。这两段序列与海洋放线菌Salinispora arenicola CNS-205的NRPS和卤化酶生物合成基因簇核心区基因核苷酸序列的同源性分别为99％和98％。最终成功地获得了稀有海洋放线菌Salinispora arenicola的NRPS和卤化酶生物合成基因簇核心区基因片段,该基因片段的获取将为分离全长基因簇以及研究该基因簇在生物合成中的功能奠定基础。

目录

文摘

英文文摘

第一章 绪论

1.1 海洋放线菌研究的历史

1.2 海洋放线菌的分布及种类

1.2.1 分布

1.2.2 种类

1.3 海洋放线菌的产生的生物活性物质

1.3.1 肽类物质

1.3.2 生物碱类物质

1.3.3 萜类物质

1.3.4 大环内酯类物质

1.3.5 醌类物质

1.3.6 聚酮类物质

1.4 非核糖体肽合成酶(NRPSs)

1.4.1 非核糖体肽合成酶的组织结构和非核糖体肽的合成

1.4.2 非核糖体肽合成酶的应用

1.5 卤化酶

1.5.1 卤化酶的组织结构和功能

1.5.2 卤化酶的应用

1.6 基因组文库的常见构建方法及意义

1.7 本研究的目的和意义

第二章 海洋放线菌基因组文库的构建

2.1 实验材料

2.1.1 菌种来源

2.1.2 试剂

2.1.3 主要仪器

2.1.4 培养基

2.2 实验方法

2.2.1 pWEB Cosmid cloning kit质量的测定

2.2.2 海洋放线菌总DNA的提取和纯化

2.2.3 插入序列的随机剪切

2.2.4 剪切后DNA的末端修复

2.2.5 获得目的大小片段的筛选

2.2.6 连接反应

2.2.7 体外包装

2.2.8 质粒文库的扩增

2.2.9 转化和文库的保存

2.2.10文库质量的检测

2.3 实验结果和分析

2.3.1 基因组DNA的提取

2.3.2 插入序列的随机剪切

2.3.3 文库效价的测定

2.3.4 文库质量的检测

2.4 本章小结

第三章 海洋放线菌功能基因的克隆和序列分析

3.1 实验材料

3.1.1 PCR引物

3.1.2 主要试剂

3.1.3 主要仪器

3.1.4 培养基

3.2 实验方法

3.2.1 总DNA的提取

3.2.2 PCR扩增

3.2.3 阳性克隆的筛选与鉴定

3.2.4 序列的生物信息学分析

3.3 结果与分析

3.3.1 总DNA的提取及检测

3.3.2 PCR扩增

3.3.3 阳性克隆的鉴定

3.3.4 测序结果及序列分析

3.3.5 系统树构建

3.4 本章小结

第四章 讨论与展望

4.1 海洋放线菌基因组文库的构建

4.1.1 关于总DNA的提取

4.1.2 克隆片段的处理

4.1.3 文库质量的鉴定

4.2 海洋放线菌功能基因的克隆

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢