家蚕浓核病毒(BmDNV-1)结构蛋白基因的表达及其启动子活性的初步研究

摘要

家蚕浓核病毒(Bombyx mori demovirus-1,BmDNV-1)属于细小病毒科(Parvoviridae),浓核病毒亚科(Densovirinae),重复病毒属(Iteravirus)。家蚕浓核病毒BmDNV-1是1968年从日本长野县病蚕中分离得到的。家蚕浓核病毒BmDNV-1感染宿主后,主要症状为病蚕软化、中肠的圆筒型细胞呈浓核症,因此对家蚕养殖业造成了巨大的危害。
　　 家蚕浓核病毒BmDNV-1病毒粒子直径大约20hm,无囊膜,病毒衣壳呈二十面体结构,其基因组为全长5076 bp的线性单链DNA,拥有两个大的重叠基因,5'端为非结构蛋白(nonstructural proteins)基因,编码两种非结构蛋白质NS1(89.3KDa)和NS2(56KDa)。其3’端部分有一简单的开放阅读框用于编码病毒的结构蛋白(structural proteins VPs),VP1(74.9KDa)、VP2(64.3 KDa)、VP3(54.9 KDa)、VP4(51.6 KDa)。最大的衣壳蛋白VP1的N-末端独特区基序具有磷脂酶A2活性,该酶活性对于病毒成功进入和感染宿主细胞是必须的,在病毒感染过程中具有重要作用。此外,家蚕浓核病毒BmDNV-1其基因组上有两个启动子,即非结构基因启动子及结构基因启动子。
　　 目前对于家蚕浓核病毒的研究主要集中于对其基因的表达,关于编码蛋白质功能和基因表达的调控等方面研究较少,由于缺乏敏感细胞系,家蚕浓核病毒BmDNV-1的转录与翻译机制目前还没报道。
　　 本文根据家蚕浓核病毒BmDNV-1的感染性克隆PIN919(GeneBank accessionnumber:AY033435)为模板设计引物扩增了VP基因的独特区vplu,构建了原核表达质粒pET-28a-vplu和pMal-e2X-vplu,进行了蛋白的诱导表达与纯化,为进一步多克隆抗体的制备打下一定基础。同时,本文利用了Bac-to-Bac杆状病毒真核表达系统成功的表达了BmDNV-1的结构蛋白VP1,并且探究了VP1与VP1-u之间的关系,结果显示,在BmDNV-1中结构蛋白基因vpl在真核表达时,没有出现VP1u的截短表达。此外,本文利用荧光素酶报告系统对BmDNV-1的结构基因启动子活性进行了初步探究,结果显示BmDNV-1结构基因启动子(VP-promoter)在Bmn细胞中基本没有活性,在C636细胞中有一定活性,在Ld652、Sf9细胞中有较高的活性,同时通过pGL-VP-promoter-luc+与调控质粒pIZT／V5-His-NS1／pIZTN5-His-NS2／pLZT／V5-His-NS共转染后测定其活性发现,NS蛋白会对VP启动子的活性起下调作用。本文为BmDNV-1的结构蛋白VP1的研究及其后期转录分析研究奠定了一定基础。

目录

文摘

英文文摘

1.前言

1.1 细小病毒科简介

1.2 浓核病毒亚科简介

1.3 家蚕浓核病毒BmDNv-1简介

1.3.1 家蚕浓核病毒BmDNV-1的发现及初步研究

1.3.2 家蚕浓核病毒BmDNV-1的三维结构结构研究

1.3.3 家蚕浓核病毒BmDNV-1vp1独特区的磷脂酶A2活性

1.4.浓核病毒转录研究进展

1.5 表达系统介绍

1.5.1 pET原核表达系统简介(pET System Manual第10版)

1.5.2 pMALTM原核表达系统简介

1.5.3 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统简介

1.5.4 pGL3 Luciferase Reporter系统简介

1.5.5.InsectSelectTm Glow System的简介

2.家蚕浓核病毒(BmDNV-1)结构蛋白VP1独特区基因的克隆、原核表达及纯化

2.1 主要实验材料

2.1.1 菌株和质粒

2.1.2 药品和试剂

2.2 常用溶液及配制

2.3 实验方法

2.3.1 氯化锂法提取质粒DNA

2.3.2 目的基因vp1u的PCR扩增

2.3.3 DNA片段的回收与纯化

2.3.4 原核表达重组质粒的构建

2.3.5 VP1u蛋白的原核表达

2.3.6 融和蛋白的SDS-PAGE和Western Blotting检测

2.3.7 优化诱导表达融合蛋白的条件

2.3.8 融合蛋白的分离纯化

2.4 结果与分析

2.4.1 目的基因vp1u的PCR扩增

2.4.2 重组质粒pET-28a-vp1u和pMal-c2X-vp1u的构建和鉴定

2.4.3 融合蛋白的诱导表达及检测

2.4.4 融合蛋白的纯化及检测

2.5 小结与讨论

2.5.1 关于克隆的构建

2.5.2 关于蛋白的表达与纯化

3.家蚕浓核病毒(BmDNV-1)结构蛋白VP1在BAC-TO-BAC杆状病毒系统中的表达

3.1 主要实验材料

3.1.1 菌株和质粒

3.1.2 药品和试剂

3.2 常用溶液及配制

3.3 引物序列

3.4 实验方法

3.4.1 目的基因vp1的PCR扩增及纯化

3.4.2 真核重组表达载体pFastBacHTA-vp1的构建

3.4.3 重组Bacmid-vp1的构建与鉴定

3.4.4 重组杆状病毒的制备

3.5 结果与分析

3.5.1 目的基因vp1的PCR扩增

3.5.2 重组质粒pFastBacHTA-vp1的构建和鉴定

3.5.3 重组Bacmid-vp1的构建与鉴定

3.5.4 重组杆状病毒的制备

3.5.5 Western Blot检测VP1和VP1-u蛋白的表达

3.6 小结与讨论

4.家蚕浓核病毒(BmDNV-1)结构基因VP启动子活性的研究

4.1 主要实验材料

4.1.1 菌株和质粒

4.1.2 药品和试剂

4.2 常用溶液及配制

4.3 引物序列

4.4 实验方法

4.4.1 结构基因启动子VP-promoter及非结构基因NS1的PCR扩增及纯化

4.4.2 重组质粒pGL3-VP-promoter-luc+、pIZT/V5-His-NS1的构建

4.4.3 细胞转染

4.4.4 荧光素酶活性的测定

4.5 结果与分析

4.5.1 目的基因VP-promoter与NS1的PCR扩增

4.5.2 重组质粒pGL3-VP-promoter-luc+、pIZT/V5-His-NS1的构建和鉴定

4.5.3 VP-promoter、NS-promoter活性的测定

4.5.4 pIZT/V5-His-NS1在几类昆虫细胞系中的转染效率测定

4.5.5 启动子活性调控实验

4.6 小结与讨论

5.全文总结与展望

5.1 全文总结

5.2 展望

参考文献

附录

在校期间发表的论文

致谢