与AcMNPVODV-E18相互作用的Sf9细胞蛋白的筛选和鉴定

摘要

杆状病毒是一类有包膜包被的双链DNA病毒，特异性感染节肢动物，是目前已知的广泛应用且对人畜无害的病毒。杆状病毒主要应用于农林害虫防治，作为真核基因表达系统用于外源基因表达、各种生物活性蛋白、和疫苗的制备。苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒AcMNPV(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus)是目前研究最多、最深入的杆状病毒代表种。
　　 杆状病毒在感染过程中产生ODV和BV两种病毒粒子。ODV病毒粒子主要负责原发感染，ODV病毒粒子必须与宿主中肠相互作用才能通过围食膜进入中肠上皮细胞中进行复制。在此过程中ODV包膜蛋白可能起重要作用。所以，研究ODV包膜蛋白对于阐述病毒在入侵宿主细胞过程的分子机制，以及改造病毒使之能得到更广泛应用具有重要的意义。
　　 AcMNPV orf143编码ODV包膜蛋白ODV-E18.其同源基因存在于已测序的所有的杆状病毒中，是31种核心基因之一。本研究以AcMNPV odv-e18为诱饵利用酵母双杂交技术从Sf9细胞cDNA文库中筛选ODV-E18相互作用蛋白基因。
　　 ⅰ)与ODV-E18相互作用蛋白基因的筛选。以AcMNPV orf143为诱饵基因，通过酵母双杂交从Sf9细胞cDNA文库中筛选出278个阳性克隆。随机挑取48个克隆，提取质粒，经PCR检测和测序归类于35个不同的cDNA序列。通过BLAST检索从数据库中找出15种同源蛋白，其中包括7种线粒体相关蛋白，6种蛋白糖基化修饰和转运相关蛋白，2种基因表达调节因子。
　　 ⅱ)E18与3种Sf9细胞蛋白的亚细胞共定位分析。根据酵母双杂交实验结果，选取三种Sf9细胞蛋白进一步检测其在病毒感染细胞内与AcMNPV E18的共定位情况。这三种蛋白分别是两种线粒体核糖蛋白(MRPS17和RPL41)和一种肌球蛋白L链(MYL9B)同源物。分别将AcMNPV orf143与egfp连接，Sf9细胞蛋白的编码序列与rfp连接，利用Bac-to-bac系统构建三个荧光报告重组病毒。根据激光共聚焦显微镜观察结果，在被感染细胞中E18-EGFP主要分布于细胞质中核膜的附近；MRPS17-RFP、RPL41-RFP和MYL9B-RFP也定位于细胞质中，RPL41-RFP与E18-EGFP在细胞核膜周围的共定位比较明显，提示E18和RPL41可能在共定位处发生相互作用。