西加毒素的检测及金黄色葡萄球菌Cna基因的克隆与表达

摘要

在论文的第一部分,本研究建立了西加毒素小鼠生物检测法和细胞毒性检测法,其检测效果优于目前世界上唯一的商品化检测西加毒素的试剂盒。小鼠检测法采用我国昆明系雄性小鼠,确定了一个鼠单位(1MU)所对应的西加毒素P-CTX-1剂量值约为9.10ng,其95％可信范围在8.67ng~9.56ng之间变动,并且建立了剂量与中间死亡时间曲线,剂量—中间死亡时间曲线为Y=244.9X-1.3937,其中Y代表致死时间,X代表剂量;在0.1ng/g、0.2ng/g、0.3ng/g三个浓度水平进行验证试验,结果表明,方法的总体回收率范围为35.23％—58.06％,该方法准确可靠,为检测提供了依据。采用小鼠神经母细胞瘤细胞Neuro-2a建立的细胞毒性检测法在毒素作用10h后检测结果最佳,检测限可达0.006μg/kg;而Cigua-Check试剂盒验证结果显示西加毒素检测试纸条在2μg/kg以上才能呈现较明显的阳性反应的定性结果。在0.05μg/kg,0.10μg/kg,0.15μg/kg三个浓度水平进行测定,结果表明,方法的回收率范围为42.03％—60.00％;方法的总体水平标准偏差为1.65％—5.37％;方法的特异性、灵敏度以及准确度均满足鱼体内毒素对人体有致毒剂量的检测分析技术要求。在论文的第二部分,为了将胶原蛋白结合蛋白(Cnap)用于金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎的疫苗的研制,本研究在对金黄色葡萄球菌进行分离鉴定筛选的基础上,提取其基因组并扩增了胶原蛋白结合蛋白(Cnap)的基因cna,然后克隆于原核表达载体pET-28a,在IPTG诱导下进行表达与纯化。
　　研究结果如下:(1)筛选出生化反应典型、毒力强的金黄色葡萄球菌菌株,提取了其基因组。(2)根据GenBank(登陆号:M81736)中公布的金黄色葡萄球菌胶原蛋白结合蛋白cna基因序列设计特异性引物,以筛选的金黄色葡萄球菌地方株的基因组DNA为模板进行扩增,获得1509 bp的DNA片段,为cna基因序列的A区域。序列分析表明,片段与GenBank中登陆的金黄色葡萄球菌胶原蛋白结合蛋白基因序列的同源性为98％;目的序列所翻译的蛋白经Clustalw分析,与参考序列(GenBank登录号:M81736)的氨基酸序列同源性也为98％。(3)将原核表达质粒pET-28a-cna转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导SDS-PAGE分析,在约55 KDa处出现了与预期目的蛋白相一致的外源蛋白带。(4)用Ni-NTA His Bind Purification Kit纯化可溶的重组蛋白,经纯化的蛋白BCA法蛋白定量结果约为1mg/mL。

目录

摘要

ABSTRACT

1 前言

1.1 西加毒素的危害及检测进展

1.1.1 西加毒素成分和性质

1.1.2 西加毒素的来源

1.1.3 西加毒素的分布

1.1.4 西加毒素毒理作用

1.1.5 西加毒素中毒的临床症状

1.1.6 西加毒素的危害

1.1.7 西加毒素在我国存在现状

1.1.8 西加毒检测技术现状

1.1.9 研究目的和意义

1.2 金黄色葡萄球菌乳房炎研究进展

1.2.1 金黄色葡萄球菌生物学特性

1.2.2 金黄色葡萄球菌流行病学

1.2.3 金黄色葡萄球菌致病性

1.2.4 金黄色葡萄球菌乳房炎疫苗研究进展

1.2.5 金黄色葡萄球菌细胞外结合基质(ECMBPs)的研究进展

1.2.6 研究目的及意义

2.材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 标准毒素、质粒与菌株

2.1.2 实验动物

2.1.3 主要试剂及材料

2.1.4 主要培养基和试剂的配制

2.1.5 基因组提取与质粒抽提鉴定试剂的配制

2.1.6 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)缓冲液的配制

2.1.7 克隆表达融合蛋白其它试剂的配制

2.1.8 寡核苷酸引物

2.2 Cigua-Check~(?)试剂盒验证的方法

2.2.1 标准毒素的稀释

2.2.2 样品的制备

2.2.3 样品检测

2.2.4 阳性对照

2.2.5 阴性对照

2.3 小鼠生物检测法方法

2.3.1 小鼠饲养

2.3.2 标准毒素的稀释

2.3.3 毒素LD_(50)值及剂量与中间死亡时间曲线关系的确定

2.3.4 加标样品的毒素回收试验

2.4 细胞毒性检测法方法

2.4.1 细胞及其培养

2.4.2 MTT细胞活力分析

2.4.3 加标样品的毒素回收试验

2.5 金黄色葡萄球菌分离培养和鉴定

2.5.1 细菌的分离培养

2.5.2 接触酶试验

2.5.3 生化鉴定试验

2.5.4 溶血检测和凝固酶试验

2.6 金黄色葡萄球菌Cna基因的克隆表达方法

2.6.1 金黄色葡萄球菌基因组DNA的提取

2.6.2 Cna序列的PCR扩增

2.6.3 PCR产物的回收与纯化

2.6.4 感受态细胞的制备(氯化钙法)

2.6.5 质粒的转化

2.6.6 质粒的小量制备

2.6.7 Cna重组克隆质粒的构建及鉴定

2.6.8 Cna重组表达质粒的构建及鉴定

2.6.9 重组质粒的诱导表达

2.6.10 SDS-PAGE分析

2.6.11 表达蛋白的纯化

3 结果与分析

3.1 Cigua-Check~(?)试剂盒验证的结果

3.1.1 阳性对照和阴性对照试验结果

3.1.2 样品检测结果

3.2 小鼠生物检测法的结果

3.2.1 小鼠中毒症状的观察

3.2.2 毒素LD_(50)值的测定

3.2.3 毒素剂量—中间死亡时间曲线和毒素剂量单位—中间死亡时间曲线的确定

3.2.4 加标样品的回收检测

3.3 细胞毒性检测法的结果

3.3.1 西加毒素与细胞作用不同时间的检测效果

3.3.2 西加毒素细胞毒性作用的形态学观察结果

3.3.3 加标样品检测结果

3.4 金黄色葡萄球菌分离培养和鉴定结果

3.4.1 细菌分离培养镜检和接触酶试验

3.4.2 生化鉴定

3.4.3 溶血检测和凝固酶试验

3.5 金黄色葡萄球菌Cna基因的克隆表达结果

3.5.1 金黄色葡萄球菌cna基因的PCR产物

3.5.2 重组表达质粒的酶切鉴定

3.5.3 序列分析

3.5.4 表达蛋白的SDS-PAGE

4 讨论

4.1 Cigua-Check~(?)试剂盒验证的讨论

4.2 小鼠生物检测法的讨论

4.3 细胞毒性检测法的讨论

4.4 金黄色葡萄球菌Cna基因的克隆与表达的讨论

5 结论

5.1 西加毒素的检测结论

5.2 金黄色葡萄球菌Cna基因的克隆与表达结论

参考文献

致谢

附录