黄瓜显微结构及类黄酮和类胡萝卜素关键酶基因表达差异的初步研究

摘要

本实验选用耐热性不同的黄瓜变种西双版纳黄瓜(Cucumber sativus L.var.xishuangbannanesis Qi et Yuan)和普通黄瓜‘华黄5号’(Cucumber sativusL.var.Huahuang NO.5)为材料,在高温胁迫条件下,观察叶片、茎、茎尖细胞显微结构的变化,并对西双版纳黄瓜和‘华黄5号’叶片、茎、瓜肉中类黄酮、类胡萝卜素关键酶基因表达差异进行了分析；从细胞学与分子生物学角度初步探讨了这两种黄瓜耐热性差异的因为,取得的主要结果如下:
　　 1.茎解剖特征的变化
　　 在高温胁迫条件下,西双版纳黄瓜茎细胞的直径比‘华黄5号’要小一些,而进细胞的长度要大于‘华黄5号’,因而其茎的节间长度要长:西双版纳黄瓜茎的维管束数量及其维管束中具有次生增厚导管的数目多于‘华黄5号’,黄瓜种间差异达到显著水平(P<0.05)。
　　 2.叶片解剖特征(叶片厚度、栅栏组织和海绵组织)的变化
　　 通过切片观察两种黄瓜的叶片厚度、栅栏组织和海绵组织的排列情况,结果表明,高温胁迫条件下,西双版纳黄瓜的栅栏组织和海绵组织排列紧密,而‘华黄5号’的栅栏组织和海绵组织细胞间有一定的空隙,通过对两者叶片的解剖结构分析,发现高温胁迫条件下,叶片厚度、栅栏组织和海绵组织的厚度差异性达到显著水平(P<0.05)。
　　 3.茎尖解剖特征的变化
　　 分析两者的茎尖后发现,高温胁迫条件下,西双版纳黄瓜与‘华黄5号’的茎顶端分生组织不断分化出新的花原基和叶原基,而后者的顶端花原基和叶原基的数量明显比前者少,并且茎顶端分化的原基伸展程度降低。在顶端分生组织与周围原基的染色反应灵敏度方面,‘华黄5号’顶端分生组织的着色较浅。
　　 4.八氢番茄红素合成酶(PSY)、番茄红素-β-环化酶(LCYb)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和查尔酮合成酶(CHS),基因克隆及其序列分析。
　　 克隆的LCYb、PSY、CHS、PAL这四个基因的碱基序列长度分别为617 bp、255bp、455 bp、400 bp。序列分析表明其开放读码框(ORF)分别为516 bp(101 bp～616 bp,编码171个氨基酸)、144bp(57 bp～200 bp,编码47个氨基酸)、450bp(3 bp～452 bp,编码149个氨基酸)和383 bp(18 bp～399 bp,编码127个氨基酸)。
　　 5.高温胁迫条件下,西双版纳黄瓜和‘华黄5号’黄瓜不同器官和组织中的PSY、LCYb、PAL和CHS基因的相对表达量。
　　 LCYb、PSY、PAL和CHS基因在西双版纳黄瓜与‘华黄5号’叶和茎中,呈先上升后下降的表达趋势,LCYb、PSY、PAL和CHS基因在胁迫处理1h-5h中,四个基因在叶片中的表达量比茎中增加的快,在随后5h-7h胁迫处理过程中,叶片中基因表达量比茎中下降幅度大,对高温胁迫过程中四个基因表达量的结果分析得出:四个基因在‘华黄5号’叶和茎中的相对表达量大于在西双版纳黄瓜叶和茎中的相对表达量。在果肉中PAL和CHS基因呈先上升后下降的表达趋势,但是PSY和LCYb在胁迫处理5h之后仍上调表达,其中PSY和LCYb两基因在果肉中的表达波动幅度比PAL和CHS基因的波动幅度大,这些结果说明LCYb、PSY、PAL和CHS基因参与了黄瓜的抗高温反应,但在不同种黄瓜,这些基因所起作用的方式可能不同。

目录

文摘

英文文摘

缩略词表

1 前言

1.1 课题的提出

1.2 高温逆境研究进展

1.2.1 高温对外观形态及细胞微观结构的影响

1.2.2 高温对内源激素的影响

1.2.3 高温下细胞膜热稳定性及保护酶系统变化

1.3 类黄酮的生物合成途径

1.3.1 苯丙氨酸解氨酶和查尔酮合成酶研究进展

1.3.2 苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因的表达特性

1.3.3 查尔酮合成酶(CHS)基因的表达特性

1.4 类胡萝卜素的生物合成途径

1.4.1 八氢番茄红素合成酶和番茄红素-β-环化酶研究进展

1.4.2 八氢番茄红素合成酶基因结构及表达特性

1.4.3 番茄红素-β-环化酶基因结构及表达特性

1.5 本课题研究的内容、目的及意义

2 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 切片制作材料

2.1.3 其他材料

2.2 实验设计

2.2.1 石蜡切片的制作

2.2.2 基因的克隆与表达

2.2.3 数据处理

3 结果与分析

3.1 高温胁迫下西双版纳黄瓜和‘华黄5号’解剖学特征的变化

3.1.1 茎解剖特征的变化

3.1.2 叶片解剖特征的变化

3.1.3 茎尖解剖特征的变化

3.2 黄瓜总RNA提取

3.3 cDNA的合成及其质量的检测

3.4 PSY、LCYb、PAL、CHS基因克隆与分析

3.4.1 西双版纳黄瓜中的PCR扩增结果

3.4.2 ‘华黄5号’中的PCR扩增结果

3.4.3 菌落PCR检测

3.4.4 测序结果及同源性分析

3.5 PAL和CHS基因在西双版纳黄瓜和‘华黄5号’叶中的相对表达量

3.6 PAL和CHS基因在西双版纳黄瓜和‘华黄5号’茎中的相对表达量

3.7 PAL和CHS基因在西双版纳黄瓜和‘华黄5号’瓜肉中的相对表达量

3.8 PSY和LCYb基因在西双版纳黄瓜和‘华黄5号’叶中的相对表达量

3.9 PSY和LCYb基因在西双版纳黄瓜和‘华黄5号’茎中的相对表达量

3.10 PSY和LCYb基因在西双版纳黄瓜和‘华黄5号’瓜肉中的相对表达量

4 讨论

4.1 黄瓜细胞学结构与其耐热性的关系

4.2 PAL和CHS基因在西双版纳黄瓜和‘华黄5号’中的差异表达

4.3 PSY和LCYb基因在西双版纳黄瓜和‘华黄5号’中的差异表达

4.4 西双版纳黄瓜和‘华黄5号’耐热性差异原因的综合探讨

4.5 本研究的后续工作研究

参考文献

致谢

图版与说明