黄瓜衰老过程中叶绿素降解相关酶基因cDNA片段的克隆与表达初步研究

摘要

叶绿素(Chlorophyll，Chl)是绿色植物叶绿体内参与光合作用的重要色素，叶绿素降解是衰老的一个重要现象，叶绿素降解是植物自然生长的结果，也可能受衰老诱导；植物衰老的一个显著标志是失绿。本文以衰老表现不同的两种黄瓜，‘华黄5号’(Cucumis sativusL.var.Huahuang5)和西双版纳黄瓜(Cucumis sativusL.var.xishuangbannanesis Qi etYuan)为试材，初步研究了野生种和栽培种衰老过程中生理生化特性，并且克隆叶绿素降解途径中的两个关键酶基因cDNA片段——脱镁叶绿素脱镁叶绿酸a水解酶(PPH)和脱镁叶绿酸a加氧酶(PAO)。应用Real-time PCR技术检测其在植株衰老过程中叶和茎中的相对表达量，探讨了PPH和PAO基因的表达模式及与抗衰老的关系，主要研究结果如下：
　　 1．黄瓜叶片衰老过程中生理生化特性
　　 黄瓜叶片衰老过程中，西双版纳黄瓜和‘华黄5号’黄瓜叶片叶绿素含量总体表现为先上升后下降。在叶片伸出15天时叶绿素含量最高，叶片伸出35天后，‘华黄5号’叶片开始出现老化症状，在45天时仅为15天的42％。而西双版纳叶片一直保持较高叶绿素含量，‘华黄5号’叶内SOD活性开始快速下降，后有微弱的上升，在35天后下降，而西双版纳黄瓜在35天时活性最高，后微弱下降，野生种SOD活性开始出现下降的时间比栽培种晚20天，可能在35天西双版纳黄瓜叶片才开始衰老。‘华黄5号’的POD活性一直呈上升趋势，而西双版纳黄瓜的POD活性变化呈双峰曲线模式，除在5天时活性低于‘华黄5号’，其余天数远远高于‘华黄5号’。西双版纳黄瓜和‘华黄5号’叶片POD活性在45天最高，在生长后期，野生种在清除活性氧方面仍强于栽培种。西双版纳黄瓜叶片中可溶性蛋白含量高于‘华黄5号’，西双版纳黄瓜在35天时蛋白含量最高，‘华黄5号’在45天时含量最高，并且可溶性蛋白质变化规律不明显。
　　 2．黄瓜茎衰老过程中生理生化特性
　　 黄瓜茎衰老过程中，西双版纳黄瓜茎在45天叶绿素含量最高，和叶片不同，西双版纳茎中叶绿素含量变化趋势不明显，茎叶绿素含量最高出现在45天，表明野生种茎可能还未进入衰老期。‘华黄5号’茎叶绿素含量在25天最高，茎中叶绿素含量先上升后下降；野生种茎中叶绿素含量高于栽培种。在栽培种和野生种茎里SOD活性变化均呈现双峰式变化趋势，西双版纳黄瓜和‘华黄5号’在35天时茎中的SOD活性最高。西双版纳黄瓜茎的POD活性一直呈上升趋势，‘华黄5号’的POD变化有呈现双峰趋势。在45天时，西双版纳黄瓜和‘华黄5号’的POD活性达到最大，并且西双版纳黄瓜茎中的POD活性始终高于‘华黄5号’。在35天时西双版纳和‘华黄5号’黄瓜茎中可溶性蛋白的含量最高，整体变化趋势是先升高后下降，在45天时最低。表明此时茎已经走向衰老。
　　 3．脱镁叶绿素脱镁叶绿酸a水解酶(PPH)和脱镁叶绿酸a加氧酶酶(PAO)基因克隆
　　 克隆的PPH和PAO基因碱基序列片段长度分别为265bp和230bp，BLAST核酸同源性在线分析表明，PPH片段与拟南芥(AT5G13800)、花椰菜(OL386R)、葡萄(XM002271131.1)和烟草(AM851012.1)的该家族基因分别具有87%、88%、80%和78%的核苷酸序列同源性，PAO片段与拟南芥(NM-114357.5)、葡萄(FJ799360.1)、花椰菜(AB470926)、毛果杨(XM002331446.1)和蓖麻(XM002523689)的该家族基因分别具有90%、86%、85%、83%和82%的核苷酸序列同源性，证明该扩增产物是PPH和PAO酶基因片段。
　　 4．西双版纳和‘华黄5号’黄瓜叶衰老过程中PPH和PAO基因的相对表达量。
　　 PPH和PAO基因在西双版纳黄瓜叶中的相对表达量的变化趋势有所不同，PPH基因的相对表达量是先上升后下降，在35天时表达量最高。PAO基因在15、25天时表达较弱，在35天时表达最强。PPH和PAO基因在‘华黄5号’叶的相对表达量与在西双版纳黄瓜叶片里表达模式基本相同，PPH基因的相对表达量是先上升后下降，在35天时表达量最高，PAO基因在15、25天时表达较弱，和在西双版纳不同的是，PAO基因在45天表达最强。这两个基因在西双版纳和‘华黄5号’叶片中表达呈正相关。
　　 5．西双版纳和‘华黄5号’黄瓜茎衰老过程中PPH和PAO基因的相对表达量。
　　 与在叶片中的表达模式相似，PPH和PAO基因在西双版纳黄瓜茎中的相对表达量的变化趋势也有所不同，PPH基因在茎中的表达趋势和在叶片中的表达趋势相同，先上升后下降，在35天时最强。PAO基因的表达变化趋势是先上升、后下降、再上升，在45天表达最强。和在西双版纳黄瓜茎里的表达模式不同，PPH和PAO基因在‘华黄5号’茎的表达模式是上升、稍微下降、上升、稍微下降。并且和5日的参照值相比都有一个较高的表达量。PPH在35天表达最强，PAO基因在15天表达最强。相关性分析表明，这两个基因在‘华黄5号’茎中表达呈正相关，而在西双版纳茎中表达呈负相关。