硝酸盐还原作用对地衣芽胞杆菌合成聚γ-谷氨酸的影响分析

摘要

硝酸盐是一种微生物可利用的重要无机氮化合物。硝酸盐在还原酶作用下经亚硝酸盐后形成氨离子。这个代谢过程对微生物具有多种生理功能，或可作为电子受体而稳定细胞膜质子梯度，或可维持胞内NAD/NADH的平衡，或可为微生物提供氮源。虽然硝酸盐还原作用的生理功能在许多微生物中被考察，但是对合成聚γ-谷氨酸（γ-PGA）的影响并没有被研究。本文首先考察硝酸盐对地衣芽胞杆菌WX-02合成γ-PGA发酵的影响。同时，建立了针对γ-PGA发酵液样品的代谢组学样品处理方法。在此基础上，应用G-C-MS分析手段，研究了代谢水平上硝酸盐代谢同γ-PGA合成之间的关系。最后，通过构建硝酸盐还原酶缺失菌株，考察了不同硝酸盐还原酶在γ-PGA发酵过程中的具体生理功能。主要结论如下:
　　 1、代谢学中常规采用的离心和膜过滤的菌体分离方法对具有粘性的γ-PGA发酵液并不适用。酸处理的方法会对造成菌体死亡，并且死亡程度随pH的增加而增加。同时，稀释-离心方法和物理研磨方法只能获得不超过30％的菌体收得率。在选择的六种淬灭溶剂（无水甲醇、无水乙醇、甲醇/乙醇混合液、10M盐酸、饱和三氯乙酸和高氯酸）中，无水乙醇最合适。同时，热乙醇是五种抽提方法（热甲醇、热乙醇、冷甲醇、冷乙醇、高氯酸冻融）中最合适的。基于乙醇的代谢组学样品处理方法能为GC-MS检测提供更强的分离效果、更多的代谢物和更好的稳定性。
　　 2、硝酸盐能有效地提高地衣芽胞杆菌WX-02的γ-PGA合成能力，其发酵终点的γ-PGA产量从22.28 mg/mL提高至35.23 mg/mL。硝酸盐代谢不仅提高了菌体对胞外谷氨酸的利用程度，也强化了胞内谷氨酸的合成能力。在γ-PGA发酵过程中，硝酸盐还原作用同糖酵解和氮循环的过程有着紧密关联。同时，硝酸盐还原作用受到了溶氧水平的显著影响。此外，地衣芽胞杆菌WX-02对硝酸盐和亚硝酸盐的耐受能力受培养基的营养丰富程度的影响。
　　 3、样品中检测到的代谢物覆盖了糖酵解途径、三羧酸循环途径、有机酸代谢和氨基酸代谢等。γ-PGA的合成时，糖酵解途径、三羧酸循环途径的代谢活性会提高，而硝酸盐还原作用会进一步强化这种激活作用从而促进更多的γ-PGA被合成。可见，硝酸盐还原作用引起的地衣芽胞杆菌WX-02胞内代谢调节程度要比γ-PGA合成更深。同时，6-磷酸葡萄糖（葡萄糖进入糖酵解的第一代谢物）、谷氨酸和谷氨酰胺（氮循环的主要代谢物）的胞内池容积的变化表明它们可能是地衣芽胞杆菌WX-02代谢网络中对γ-PGA合成和硝酸盐还原作用都响应的重要节点。此外，部分代谢物的合成显示出依赖性。L-半胱氨酸只出现在硝酸盐还原作用下，而三磷酸甘油醛、戊二酸和L-丙氨酸在γ-PGA合成时积累，乙酰乙酸、丙二酸和L-缬氨酸则只在不合成γ-PGA状态下积累。丙酸是唯一的需两个作用都存在才积累的胞内代谢物。
　　 4、呼吸硝酸盐还原酶是地衣芽胞杆菌WX-02在γ-PGA合成期间的唯一的硝酸盐还原酶。同化硝酸盐还原酶对菌株的亚硝酸盐还原过程产生巨大的影响。在地衣芽胞杆菌WX-02γ-PGA发酵过程中，硝酸盐还原作用是一个呼吸-同化过程。完整的硝酸盐还原作用途径有助于细胞利用更用的外源谷氨酸。同时，这两种还原酶的生理功能同培养基中无机氮源的组合有关。另外，硝酸盐还原途径的完整性对地衣芽胞杆菌WX-02对胞外柠檬酸的利用、胞内乙酸和乙偶姻的代谢也都有显著影响。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 聚-γ-谷氨酸

1．1．1 聚-γ-谷氨酸简介

1．1．2 生物合成聚-γ-谷氨酸的微生物

1．1．3 聚-γ-谷氨酸生物合成基因及蛋白

1．1．4 聚-γ-谷氨酸生物合成调控

1．2 硝酸盐还原作用

1．2．1 微生物硝酸盐代谢简介

1．2．2 硝酸盐代谢相关蛋白

1．2．3 硝酸盐还原酶基因表达和活性的调控

1．3 代谢组学

1．3．1 代谢组学简介

1．3．2 细胞淬灭方法

1．3．3 胞内代谢物抽提方法

1．3．4 代谢组学在微生物研究中的应用

1．4 研究目的与意义

第二章 高粘性聚-γ-谷氨酸发酵液的代谢组平台的建立

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．2．1 样品的制备

2．2．2 细胞淬灭

2．2．3 能量物质的检测

2．2．4 胞内代谢物的抽提

2．2．5 待测样品的衍生化

2．2．6 GC-MS检测

2．2．7 标准品GC-MS检测结果

2．2．8 样品重现率

2．2．9 粘度的测定

2．2．10 活菌数的测定

2．2．11 数据处理

2．3 结果与分析

2．3．1 针对γ-PGA发酵液中的菌体不同收集方法的评价

2．3．2 代谢组学样品处理过程中可能干扰因素的考察

2．3．3 淬灭溶剂的评价

2．3．4 菌体洗涤液浓度的优化和洗涤次数的优化

2．3．5 胞内代谢物抽提方法的选择

2．4 结论

第三章 硝酸盐还原作用在地衣芽胞杆菌WX-02聚γ-谷氨酸发酵的影响

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．2．1 菌株及其培养条件

3．2．2 细菌数的测定

3．2．3 发酵液中残留单体L-谷氨酸及其利用率的测定

2．2．4 发酵液中残留葡萄糖及其利用率的测定

3．2．5 HPLC法测定聚-γ-谷氨酸浓度

3．2．6 硝酸盐浓度的测定

3．2．7 亚硝酸盐浓度的测定

3．2．8 数据处理

3．3 实验结果与分析

3．3．1 地衣芽胞杆菌WX-02对硝酸盐和亚硝酸盐的耐受能力分析

3．3．2 硝酸盐对地衣芽胞杆菌WX-02聚-γ-谷氨酸生成的影响

3．3．3 硝酸盐还原作用对地衣芽胞杆菌WX-02聚-γ-谷氨酸发酵过程影响

3．3．4 聚-γ-谷氨酸发酵过程中硝酸盐变化过程

3．3．5 主要碳源和聚-γ-谷氨酸前体物对地衣芽胞杆菌WX-02硝酸盐还原的影响

3．3．6 不同溶氧环境对硝酸盐还原作用的影响

3．4 结论

第四章 聚γ-谷氨酸发酵过程中的硝酸盐还原作用GC-MS胞内代谢组学研究

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．2．1 菌株

4．2．2 发酵样品的制备

4．2．3 细胞淬灭

4．2．4 胞内代谢产物抽提

4．2．5 待测样品衍生化方法

4．2．6 GC-MS条件

4．2．7 代谢物的鉴定和浓度计算

4．2．8 活菌数的检测

4．2．9 数据处理

4．3 结果与分析

4．3．1 取样点

4．3．2 数据总体结果分析

4．3．3 胞内代谢物浓度变化分析

4．3 结论

第五章 硝酸盐还原酶在聚-γ-谷氨酸生物合成中的生理功能

5．1 前言

5．2 材料与方法

5．2．1 基础分子生物学试剂

5．2．2 菌株和质粒

5．2．3 PCR引物

5．2．3 硝酸盐还原酶缺失工程菌株的构建

5．2．4 聚-γ-谷氨酸发酵条件

5．2．5 相关生理指标的检测

5．2．6 胞外代谢物的HPLC检测

5．2．7 胞外代谢物的GC检测

5．2．8 数据处理

5．3 结果与分析

5．3．1 硝酸盐还原酶工程菌的构建

5．3．2 不同无机氮源组合对WX-02合成γ-PGA的影响

5．3．3 不同无机氮源组合对WX-02菌体生长和发酵液pH的影响

5．3．4 不同无机氮源组合对WX-02利用葡萄糖和谷氨酸的影响

5．3．5 硝酸盐还原酶缺失对菌体合成γ-PGA能力的影响

5．3．6 硝酸盐还原酶缺失对菌株生长能力和发酵终点pH的影响

5．3．7 硝酸盐还原酶缺失对菌体利用葡萄糖和谷氨酸能力的影响

5．3．8 硝酸盐还原酶缺失对硝酸盐代谢的影响

5．3．9 硝酸盐还原酶缺失对柠檬酸代谢的影响

5．3．10 硝酸盐还原酶缺失对丙酮酸溢流代谢的影响

5．4 结论

第六章 讨论与展望

6．1 结论

6．2 讨论

6．3 展望

参考文献

致谢

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