温度和亚硝酸盐对草鱼肾细胞、血细胞及肝细胞抗氧化体系的影响

摘要

为探究温度和亚硝酸盐对草鱼（ctenopharyngodonidellus）组织细胞的应激作用及其细胞水平的反应机理，本文进行了以下三个方面的研究:(1)温度对草鱼肾细胞(CIK)的氧化与抗氧化指标及抗氧化物酶相关基因表达水平的影响;(2)亚硝酸盐对草鱼离体血细胞的胞内氧化及抗氧化指标、血红蛋白及高铁血红蛋白含量、及抗氧化物酶相关基因表达水平的影响;(3)亚硝酸盐对草鱼离体肝细胞的抗氧化物酶活性的影响。
　　在研究(1)中采用的实验细胞为来自华中农业大学水产学院的CIK传代细胞。在研究(2)和(3)中采用体质量为(65.8±5.5)g的草鱼幼鱼为材料，在无菌条件下提取草鱼血细胞并制备离体肝细胞，设置3个亚硝酸盐暴露组(1.0mg/L、10.0mg/L、100.0mg/L)和1个空白对照组（0mg/L组），各实验组设置3个重复，离体血细胞实验分别暴露0h、3h、6h、12h、24h，离体肝细胞实验分别暴露0h、6h、12h、24h、48h、96h。研究结果如下:
　　1.温度对草鱼肾细胞的氧化应激水平的影响
　　在急性温度变化下，无论升高温度4℃或者降低温度4℃都会导致胞内氧化应激水平发生改变，这主要体现在活性氧(ROS)水平的升高，线粒体跨膜电位（△Ψm）发生显著性升高，细胞的脂质氧化损伤指标丙二醛(MDA)的显著增加，高温诱导的蛋白质氧化指标蛋白质羰基化含量的持续升高。低温显著性的影响胞内总抗氧化能力(TAC)活性，升温处理和降温处理对谷胱甘肽(GSH)活性的升高也具有显著性影响。对酶活指标的分析中，在升温和降温中都检测到超氧化物歧化酶(SOD)，谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和过氧化氢酶(CAT)活性高于对照组，谷胱甘肽还原酶(GR)活性在升温组中表现出随温度升高而升高，在基因的转录水平上，通过对sod，cat，gpx三个基因的荧光定量分析发现，无论是升温处理还是降温处理，这3个抗氧化物酶基因的转录水平都高于对照组28℃组的水平。
　　2.亚硝酸盐急性暴露对草鱼氧化及抗氧化指标和抗氧化酶基因水平的影响
　　亚硝酸盐暴露对草鱼血细胞的活性氧、血红蛋白含量、过氧化脂质的含量、线粒体跨膜电位和关键代谢酶活性及其基因的相对表达量均产生了显著影响。亚硝酸盐对草鱼血细胞的影响作用体现出剂量—效应和时间—效应关系。随着亚硝酸盐的暴露浓度的升高，胞内的ROS水平、线粒体跨膜电位、脂质氧化指标MDA均表现出先升高后降低的趋势;CAT，SOD，GPx，谷胱甘肽巯基转移酶(GST)，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)，乳酸脱氢酶(LDH)的酶活性表现出先升高后降低的趋势，GSH和TAC活性同样也表现出先升高后降低的趋势;对抗氧化相关酶活基因的研究发现，同一时间点，sod，cat，gpx基因的转录水平都会随着亚硝酸盐的暴露浓度的增加而表现出先升高后降低的趋势。活性氧水平的升高预示机体的自由基代谢能力的变化和氧化应激水平的加剧。长时间低浓度的亚硝酸盐暴露对细胞造成的损伤超出细胞自身的抗氧化修复能力。
　　3.亚硝酸盐急性暴露对草鱼离体肝细胞抗氧化性能的影响
　　亚硝酸盐急性暴露对草鱼离体肝细胞的非特异性免疫和抗氧化性能产生了显著影响，SOD、CAT、LDH、GST、γ-GCS、GSH和TAC都随着亚硝酸盐的作用浓度和作用时间的变化而表现出先升高后降低的趋势，低浓度的亚硝酸盐的长时间处理导致酶活性的显著升高预示着离体肝细胞内非特异性免疫性能的增强和胞内自由基的代谢能力的提高，同时也预示着胞内的氧化应激程度的提高。

目录

声明

摘要

缩略语表

第一章 文献综述

1．1 温度和亚硝酸盐对水生动物的抗氧化系统和组织器官的影响

1．2 氧化应激的产生与活性氧对水生动物的影响

1．3 氧化应激与水生动物的非特异性免疫反应

1．4 氧化应激对水生动物基因表达水平的作用机制及其影响

1．5 研究目的与意义

第二章 温度对草鱼肾细胞的氧化应激水平的影响

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．2．1 草鱼肾细胞的培养

2．2．2 草鱼肾细胞的处理

2．2．3 活性氧的检测

2．2．4 线粒体跨膜电位的检测

2．2．5 抗氧化相关指标的检测

2．2．6 蛋白质及脂质氧化损伤的检测

2．2．7 抗氧化物酶基因表达的定量PCR检测方法

2．3 数据处理

2．4 结果与分析

2．4．1 温度对CIK细胞内活性氧的影响

2．4．2 氧化损伤指标

2．4．3 抗氧化物酶活性

2．4．4 氧化还原状态

2．4．5 抗氧化酶基因的转录水平

2．5 讨论

第三章 亚硝酸盐对草鱼血细胞的氧化应激水平的影响

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．2．1 离体血细胞的培养

3．2．2 实验设计

3．2．3 血细胞内活性氧的检测

3．2．4 血细胞线粒体跨膜电位的检测

3．2．5 血细胞内抗氧化防御相关指标的检测

3．2．6 血细胞内脂质损伤水平及血红蛋白和高铁血红蛋白的检测

3．2．7 血细胞内抗氧化物酶基因表达的定量PCR检测方法

3．3 数据处理

3．4 结果与分析

3．4．1 亚硝酸盐对血细胞的活性氧的影响

3．4．2 亚硝酸盐对血细胞的氧化损伤状态指标的影响

3．4．3 亚硝酸盐对血细胞内血红蛋白和高铁血红蛋白含量的影响

3．4．4 亚硝酸盐对血细胞内抗氧化相关酶活的影响

3．4．5 亚硝酸盐对血细胞内氧化还原状态指标的影响

3．4．6 亚硝酸盐对血细胞内抗氧化物酶基因表达的影响

3．5 讨论

第四章 亚硝酸盐暴露对草鱼离体肝细胞氧化应激水平的影响

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．2．1 离体肝细胞的获取

4．2．2 实验设计与处理

4．2．3 肝细胞内抗氧化相关指标的检测

4．3 数据处理

4．4 结果与分析

4．4．1 亚硝酸盐对离体肝细胞的超氧化物歧化酶的影响

4．4．2 亚硝酸盐对离体肝细胞的过氧化氢酶的影响

4．4．3 亚硝酸盐对离体肝细胞的乳酸脱氢酶的影响

4．4．4 亚硝酸盐对离体肝细胞的谷胱甘肽转移酶的影响

4．4．5 亚硝酸盐对离体肝细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的影响

4．4．6 亚硝酸盐对离体肝细胞的谷胱甘肽的影响

4．4．7 亚硝酸盐对离体肝细胞的总抗氧化能力的影响

4．5 讨论

参考文献

致谢