鲢低氧诱导下细胞凋亡检测及细胞周期相关基因的克隆和表达分析

摘要

鲢（Hypophthalmichthys molitrix）是我国主要的淡水养殖鱼类之一，其养殖模式和养殖技术已经完全成熟，但是鲢对低氧环境比较敏感且耐受程度低，易发生大面积的泛塘现象。本文以鲢为研究对象，开展了其细胞周期蛋白(Cyclin)相关基因(CyclinA、CyclinB、CyclinD和CyclinE)、细胞周期检测点激酶（Chk1）和细胞周期分裂素基因（Cdc25A）的克隆、组织表达以及低氧胁迫过程中这几个细胞周期相关基因在鲢脑、肝脏、鳃三个与呼吸相关的组织器官中的表达分析。同时我们通过流式细胞分析法以及TUNEL法检测低氧诱导下鲢肝、脑细胞凋亡情况。实验结果如下:
　　1.鲢细胞周期相关基因的克隆及低氧胁迫下的表达分析根据GenBank中斑马鱼的细胞周期相关基因序列对保守区引物进行设计，采用同源克隆和RACE技术获得了鲢CyclinA、CyclinB和CyclinE全长序列，并扩增CyclinD、Chk1和Cdc25A基因的核心片段。CyclinA基因全长1654bp，5'非编码区73bp，3'非编码区396bp，最大开放阅读框1185bp，编码394个氨基酸;CyclinB基因全长1523bp，5'非编码区77bp，3'端252bp，最大开放阅读框1194bp，编码397个氨基酸;CyclinE基因全长1881bp，5'非编码区212bp，3'非编码区430bp，最大开放阅读框1239bp，编码412个氨基酸。氨基酸序列同源一致性比对结果显示，鲢CyclinA和CyclinB基因与鲤鱼的这两个基因氨基酸序列同源一致性最高，分别是99％和100％，CyclinE基因与斑马鱼的CyclinE基因氨基酸序列同源一致性最高为99％。
　　半定量RT-PCR检测结果显示，CyclinA基因在肝和脑中表达量较高，在鳃中表达量较低;CyclinB基因在心脏中表达量较高，在其他的组织中表达量较低;CyclinD基因在肝、脑、肾和心脏中的表达量比较高，在其他组织中的表达比量较低;CyclinE基因在肌肉、脑和肝中表达量较高，在其他组织中表达量较低;Chk1基因在肝和脑中表达量较高，在脾中不表达，在其他组织中表达量较低;Cdc25A基因在心脏、脑、肝中表达量较高，在鳃中表达量较低，在其他组织中不表达。Real-time PCR检测结果显示，鲢由正常情况下低氧胁迫至浮头再到死亡的过程中，在肝脏中，CyclinA和CyclinE基因表达量逐渐下降(P＜0.05);CyclinB和CyclinD基因表达量无明显变化(P＞0.05);Chk1基因表达量先升高然后下降(P＜0.05); Cdc25A基因表达量先下降后升高（P＜0.05）。在脑中，CyclinA和Cdc25A基因表达量先下降然后上升(P＜0.05); CyclinB和CyclinD基因表达量无明显变化(P＞0.05);CyclinE基因表达量呈现下降趋势(P＜0.05); Chk1基因表达量先升高然后下降(P＜0.05);在鳃脏中，CyclinA和CyclinE基因表达量逐渐下降(P＜0.05); CyclinB和CyclinD基因表达量无明显变化（P＞0.05）;Chk1基因表达量先升高然后下降(P＜0.05); Cdc25A基因表达量先下降后升高(P＜0.05)。本研究中结果显示四个细胞周期蛋白基因CyclinA、CyclinE、细胞周期检测点激酶Chk1和细胞周期分裂素基因Cdc25A的表达受低氧应激的调节。
　　2.AnnexinV/PI流式细胞分析法和TUNEL法检测低氧诱导下鲢肝、脑细胞凋亡情况本实验通过Annexin V/PI流式细胞分析法和TUNEL法检测低氧胁迫下鲢肝、脑细胞的凋亡情况。Annexin V/PI流式细胞仪分析，在肝脏中细胞凋亡率依次是对照组8.85±0.24、浮头期22.06±0.57、死亡期22.91±0.49;在脑中细胞凋亡率依次是对照组8.18±0.45、浮头期24.80±0.63、死亡期24.86±0.21。TUNEL法检测显示，在肝脏中细胞凋亡率是对照组3.80±0.16、浮头期36.78±0.34、死亡期37.27±0.35;在脑中细胞凋亡率依次是对照组6.74±0.30、浮头期35.04±0,40、死亡期35.71±0.41。结果表明与正常对照组比较，低氧胁迫后鲢肝、脑细胞凋亡显著增加，但在死亡时期凋亡细胞数目却没有明显差异。

目录

声明

摘要

缩略语表

第一章 前言

1．1 鲢的生物学特性及育种研究

1．2 细胞周期蛋白

1．3 细胞周期检测点激酶Chk1和细胞周期分裂素Cdc25A

1．4 细胞凋亡研究

1．4．1 细胞凋亡介绍

1．4．2 低氧应激对细胞凋亡的影响

1．5 细胞周期与细胞凋亡的相互关系

1．5．1 细胞周期和细胞凋亡之间相互偶联

1．5．2 细胞周期与细胞凋亡的连接点

1．5．3 DNA损伤与细胞周期和细胞凋亡的关系

1．6 技术路线

1．7 实验试剂及仪器

1．7．1 主要试剂

1．7．2 实验仪器

1．7．3 研究目的及意义

第二章 鲢细胞周期相关基因全长的克隆及表达分析

2．1 材料与方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 组织中总RNA的提取

2．1．3 总RNA反转录

2．2 实验方法

2．2．1 细胞周期相关基因中间片段扩增

2．2．2 鲢CyclinA，CyclinB和CyclinE基因全长及CyclinD编码区的扩增

2．2．3 PCR产物回收

2．3 结果与分析

2．3．1 鲢三个细胞周期蛋白基因的生物信息学分析

2．3．2 鲢细胞周期相关基因的表达分布

2．3．3 低氧胁迫下鲢几个细胞周期相关基因的mRNA表达变化分析

2．4 讨论

第三章 Annexin V／PI流式细胞分析法和TUNEL法检测低氧诱导下鲢肝、脑细胞凋亡情况

3．1 材料

3．1．1 供试动物

3．1．2 试剂及仪器

3．2 方法

3．2．1 低氧处理

3．2．2 单细胞悬液的制备

3．2．3 流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡

3．2．4 TUNEL法检测细胞凋亡(王发渭等2012)

3．3 结果与分析

3．3．1 Annexin V／PI流式细胞分析法检测低氧胁迫下鲢肝、脑细胞凋亡情况

3．3．2 TUNEL法检测低氧胁迫下鲢肝、脑细胞凋亡情况

3．4 讨论

3．4．1 低氧胁迫下鲢肝细胞凋亡检测结果分析

3．4．2 低氧胁迫下鲢脑细胞凋亡检测结果分析

3．4．3 低氧诱导细胞凋亡的临界值

3．4．4 比较分析两种方法检测细胞凋亡的优缺点

参考文献

硕士期间发表的主要论文

附录

致谢