猪博尔病毒NPO8株的基因组序列分析及其对猪肠上皮细胞的影响

摘要

猪博卡病毒(Porcine bocavirus，PBoⅤ)是2009年首先在患有断奶仔猪多系统衰竭综合征的猪淋巴结中检测到的一种单股线状DNA病毒，在国内外猪群中广泛存在，可能是仔猪腹泻病重新暴发的一个重要原因。因此，开展PBoⅤ的研究具有重要意义。本研究对猪博卡病毒的流行情况、基因组和对猪肠上皮细胞的作用进行了初步研究，分别在基因水平和细胞水平上阐述该病毒感染机体后对机体产生的可能影响，为研究该病毒的致病性提供思路。主要研究结果如下:
　　1.PBoⅤ的PCR检测:对2013年3月至2014年12月腹泻猪场中的猪群样本进行PBoⅤ PCR检测，523份腹泻病料中阳性134份，检出率为25.62％，其中血清、粪便和组织的检出率分别为76％、49％和5％;对某屠宰场健康猪群的184份样本进行检测，共检出阳性87份，检出率为47.28％，其中粪便、肠系膜淋巴结和下颌淋巴结的检出率分别为68％、36％和2％。
　　2.PBoⅤ/NP08株基因组序列分析:参考Genbank收录的PBoⅤ基因组全序列，根据保守位点设计6对引物，以PCR检测阳性的1份腹泻病料提取的DNA为模板，完成PBoⅤ的全基因组测序，将该毒株命名为PBoⅤ/NP08并提交至GenBank数据库，登录号:KR014255。该毒株序列全长4745bp，与PBoⅤ/Buk-1和PBoⅤ/SX的核苷酸同源性均为99％，与PBoⅤ/H18的核苷酸同源性为90％;具有3个开放阅读框(ORFs)，分别编码NP1、NS1、VP1和VP2四种病毒蛋白。
　　3.PBoⅤ的基因群及VP1独有区(VP1u)上的磷脂酶A2(PLA2)保守序列分析:根据国际病毒分类委员会关于博卡病毒的分类标准，将在Genbank上发布的47株PBoV分为6个基因群，PBoⅤ/NP08属于基因群Ⅴ。首次发现基因群Ⅰ-Ⅳ的VP1u氨基酸序列中含有“HDXXY”和“YXGXF”保守基序，但基因群Ⅴ和基因群Ⅵ的VP1u氨基酸序列中这两个保守基序缺失。
　　4.猪肠上皮细胞(IPEC-J2)感染PBoⅤ后的形态学和细胞因子表达变化:将PBoⅤ/NP08接种IPEC-J2细胞，培养48h后出现肿胀、堆积、脱落等细胞病变。在病毒接种细胞后的12-72h，IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α和IFN-γ等炎性因子的表达均上调，尤其是IL-6的表达在整个过程中均极显著上调;转化生长因子TGF-β1的表达在整个过程中也极显著上调。

目录

论文说明

声明

摘要

缩略词(Abbreviation)

1 前言

1．1 研究问题的由来

1．2 博卡病毒的概况

1．2．1 博卡病毒的简介

1．2．2 博卡病毒的基因组特征

1．2．3 博卡病毒的分类

1．3 猪博卡病毒的研究进展

1．3．1 猪博卡病毒的发现

1．3．2 猪博卡病毒基因组特征及其分类

1．3．3 猪博卡病毒的流行病学研究

1．3．4 猪博卡病毒的检测方法研究

1．3．5 猪博卡病毒的致病性分析

1．4 研究目的和意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 载体及菌株

2．1．2 细胞株

2．1．3 主要试剂和耗材

2．1．4 主要仪器

2．1．5 主要溶液配制

2．1．6 基因分析主要参考序列

2．2 方法

2．2．1 猪博卡病毒的PCR检测

2．2．2 猪博卡病毒基因的扩增、测序和基因序列分析

2．2．3 病毒的分离培养

2．2．4 猪肠上皮细胞(IPEC-J2)感染猪博卡病毒后细胞的形态学和细胞因子表达变化

3 结果与分析

3．1 猪博卡病毒的PCR检测

3．2 猪博卡病毒基因的扩增、测序和基因序列分析

3．2．1 猪博卡病毒基因的扩增和测序

3．2．2 猪博卡病毒PBoV／NP08株编码基因的序列分析

3．2．3 VPlu上的磷脂酶A2(PLA2)保守基序分析

3．3 病毒对细胞的作用研究

3．3．1 病毒的分离培养

3．3．2 猪肠上皮细胞(IPEC-J2)感染猪博卡病毒后的形态学变化

3．3．3 猪肠上皮细胞(IPEC-J2)感染猪博卡病毒后细胞因子表达变化

4 讨论

4．1 猪博卡病毒的PCR检测

4．2 猪博卡病毒全基因组序列的扩增

4．3 猪博卡病毒的序列分析及病毒的分离培养

4．4 猪肠上皮细胞(IPEC-J2)感染猪博卡病毒后细胞的形态学和细胞因子表达变化

结论

参考文献

致谢