杜洛克猪妊娠12天与空怀对照子宫内膜转录组与miRNA表达谱分析

摘要

母猪妊娠11-12天（GD11-12）是胚胎着床的窗口期，研究妊娠11-12天与空怀对照的母猪子宫内膜有助于揭示影响胚胎着床的分子机理。本试验以杜洛克猪种妊娠12天与发情后空怀12天母猪的子宫为研究对象，分别设三个生物学重复，利用组织切片技术初步探讨子宫内膜形态学变化与同步发育对胚胎着床的影响；并基于RNA-seq技术，对其子宫内膜进行illumina HiSeqTM2500高通量测序，在转录组水平上剖析了影响妊娠12天杜洛克母猪子宫内膜胚胎着床的关键差异基因、lncRNA、miRNA与功能通路。
　　主要研究结果如下：
　　1、利用组织切片技术观察发现：与空怀12天子宫相比，妊娠12天子宫增厚，内膜组织变疏松，组织间隙变大，充满组织液；内膜腔上皮变细变薄，且出现明显褶皱；子宫内膜进入分泌期，腺体增长增大，弯曲，出现明显的腺体腔，腺体细胞出现核下空泡，腺体分泌活跃，推测这些组织形态学变化有利于胚胎着床与发育。
　　2、通过RNA-seq测序，以猪基因组数据库Sscrofa10.2为参考数据库，每个样本得到能比对到参考数据库上mRNA、ncRNA的reads有7千多万个，得到能比对到参考数据库上miRNA的reads有5百多万到7百多万个不等。以妊娠12天母猪为实验组，空怀12天为对照组，经过生物信息学分析，在妊娠12天（实验组）与发情后12天（对照组）之间发现了237个差异表达的转录本，199个上调表达，38个下调表达，其中包含差异上调lncRNA30个，差异下调lncRNA3个；差异的miRNA仅1个，且上调。
　　3、差异mRNA的生物信息学分析结果：对差异表达基因进行GO（Gene Ontology）与KEGG（Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes）分析，结果显示杜洛克母猪胚胎着床的作用机制与功能主要参与分子功能和生物学过程，与粘附性、分泌作用、转运子等功能相关；差异表达基因主要富集在MAPK信号通路、Wnt信号通路、氮代谢通路、矿物吸收通路、蛋白消化与吸收通路等。
　　4、差异lncRNA的生物信息学分析结果：本试验筛选出长非编码RNA（lncRNA）1490个，其中差异表达的lncRNA33个。差异表达的lncRNA靶基因GO富集显示：表达量有差异、显著富集且高表达的靶基因主要与细胞膜、代谢程序、转运子活性等相关；KEGG分析显示：富集度高、表达量高且差异表达的lncRNA靶基因主要与Wnt信号通路、癌症通路、细胞周期、胃酸分泌、蛋白消化与吸收通路等相关。
　　5、差异miRNA的生物信息学分析结果：高通量测序检测到各样本比对到已知miRNA的small RNA的数量约有500多万个，差异表达显著的miRNA仅1个，ssc-miR-132。GO富集分析发现其靶基因主要参与分子功能与生物学过程，大多与调控子活性相关。通过Pathway分析，差异miRNA的靶基因主要富集在MAPK信号通路、矿物吸收通路、内吞作用通路等。
　　6、通过生物信息学联合分析知，S100A8、S100A12、FGF9、IL1R2、CD14、MAP4K4等基因可能是影响胚胎着床的关键基因；TCONS_00343128、TCONS_01094592、TCONS_05822728、TCONS_01295521与TCONS_01286535等lncRNA可能是影响胚胎着床的候选lncRNA；差异miRNA ssc-miR-132可能参与胚胎着床过程中的关键调控。MAPK信号通路、细胞周期通路、矿物吸收通路、Wnt信号通路和p53信号通路等通路可能是影响胚胎着床的关键信号通路，其中MAPK信号通路可能在胚胎着床在过程中起十分关键的作用。

目录

声明

缩略语表（Abbreviations）

1 前言

1.1 胚胎着床期子宫内膜的组织形态学研究进展

1.2 胚胎着床期的生理学研究进展

1.3 猪胚胎着床分子机制的研究进展

1.4研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 实验材料与分析软件

2.2 子宫内膜组织切片HE染色

2.3 转录组测序文库的构建及测序

2.4 生物信息学分析

2.5 RNA反转录与定量PCR验证

3 结果与分析

3.1 子宫内膜组织切片结果

3.2高通量测序结果

3.3 差异表达分析

3.4 GO功能显著性富集分析

3.5 pathway分析

3.6 测序数据可靠性的定量PCR验证结果

4 讨论

4.1 胚胎着床窗口期子宫内膜组织形态学的同步变化

4.2 影响胚胎着床的候选基因

4.3 影响胚胎着床的候选lncRNA

4.4 影响胚胎着床的miRNA

4.5 影响胚胎着床的关键信号通路

4.6 后续研究计划

5 结论

参考文献

附录

致谢