HSP-90抑制对福美双诱导的胫骨软骨发育不良肉鸡生长板细胞外基质降解的影响

摘要

肉鸡胫骨软骨发育不良(TD)是由不同病因引起的与跛行相关的骨骼失调性疾病。主要特征是病变区细胞缺少基质蛋白酶以及软骨区形成无矿化、无血管化的软骨栓。
　　1.细胞外基质蛋白诱导因子(EMMPRIN/CD147)在肉鸡胫骨软骨发育不良过程中的差异性表达
　　细胞外基质金属蛋白酶诱导剂(CD147)广泛存在于各种细胞中，它可以通过多种途径直接诱导产生细胞外基质金属蛋白酶(MMPs)。本实验的主要目的是研究细胞外基质蛋白诱导因子(EMMPRIN/CD147)在正常组、福美双诱导肉鸡TD组和肉鸡TD恢复组间的基因表达差异。实验选择一种细胞外基质降解酶基质金属蛋白酶-9(MMP-9)为对象来研究CD147对细胞外基质(ECM)降解的影响。应用荧光定量PCR检测各组靶基因表达水平，免疫组化和蛋白印记研究靶蛋白分布和表达状况。实验肉鸡被随机分为三组:对照组、TD发生组和TD治疗组。结果显示，TD发生组CD147和MMP-9的基因表达出现下调;TD治疗组CD147和MMP-9基因水平得到恢复，表达量显著增加。蛋白印记分析结果同样表明在肉鸡TD发生过程中CD147蛋白水平合成量减少，而在TD恢复期，CD147蛋白合成量增加。以上结果表明，细胞外基质蛋白降解障碍在肉鸡胫骨软骨发育不良时起到有决定性的作用，而肉鸡TD的恢复与CD147介导的肉鸡细胞外基质蛋白的水解关系密切，这一结果与其他动物的研究结果相近。
　　2.Hsp-90抑制剂对肉鸡胫骨软骨发育不良时细胞外基质蛋白降解的影响
　　本实验主要研究Hsp-90抑制剂在肉鸡胫骨软骨发育不良时对细胞外基质蛋白降解的影响。实验用CD147、 MMP-2和MMP-9的基因表达量来反映细胞外基质蛋白的降解情况。用Hsp-90和血管内皮生长因子VEGF及其受体Flk-1基因的表达量来反映血管的生成状况。结果显示，Hsp-90抑制剂引起血管生成因子Flk-1基因表达上调，促进福美双诱导的肉鸡胫骨软骨发育不良发病时生长板的恢复，跛行消失。此外，对TD肉鸡给予Hsp-90抑制剂后CD147、MMP-2和MMP-9的基因表达量均得到显著恢复，这些变化提示Hsp-90抑制剂能有效的防治肉鸡TD。在TD恢复期，Hsp-90抑制剂的应用不仅增强了血管内皮生长因子，还加速了细胞外基质蛋白的降解，从而促进了生长板的恢复和跛行的缓和。以上结果揭示Hsp-90抑制剂与细胞外基质蛋白的降解有密切的关系，Hsp-90抑制剂可以促进血管生长和细胞外基质蛋白的降解，从而使得发生胫骨软骨发育不良的肉鸡生长板得以恢复。
　　3.Hsp-90抑制剂格尔德霉素对福美双诱导的TD肉鸡肝脏功能的影响
　　本实验主要研究Hsp-90抑制剂格尔德霉素(17-DMAG)对福美双诱导的TD肉鸡肝脏功能和抗毒性能力的影响。120只商品化的肉鸡随机分成三组:对照组、福美双组和17-DMAG治疗组。在喂养的第11天和14天，采血分离得到血清样品，用于检测肝脏丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)和碱性磷酸酶(ALP)活性。实验同时提取各组鸡的肝脏总蛋白，用以检测超氧化物歧化酶(SOD)，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)活性。结果表明:福美双组血清ALT、 AST和肝脏MDA水平升高，而血清ALP和肝脏抗氧化酶(SOD、GSH-Px)水平降低。而在17-DMAG治疗组，这些指标均得到有效恢复，浓度接近于对照组的水平。以上结果表明，17-DMAG能够有效恢复和降低福美双诱导的肉鸡肝脏氧化损伤和毒性损害。
　　4.肉鸡胫骨软骨发育不良发病期和恢复期Matrlin-3和Cyclin-Ⅰ基因表达情况
　　Matrilin-3，是Matrilins家族中最小成员。在人类和小鸡中表达有着很高的相似性。它能够连接各种大分子并且提高软骨细胞和细胞外基质(ECM)的协同作用。Cyclin-Ⅰ，是细胞周期蛋白家族的一员，它能够通过调节细胞周期素依赖性激酶活性，来调节细胞周期进程。本实验的主要目的是研究肉鸡胫骨软骨发育不良发病期和恢复期Matrilin-3和Cyclin-Ⅰ的基因表达情况。试验应用荧光定量PCR检测各组靶基因表达水平，免疫组化和蛋白印记研究靶蛋白分布和表达状况。结果显示，肉鸡胫骨软骨发育不良发病时，Matrilin-3和Cyclin-Ⅰ基因表达量均出现减少，蛋白合成水平也同步下降，病变区软骨细胞没有分化的迹象。相反，在TD恢复期，这两个基因的mRNA转录水平和蛋白表达水平均显著升高。这些结果表明，Matrilin-3和Cyclin-Ⅰ的基因、蛋白表达对肉鸡胫骨软骨发育不良发病期和恢复期的细胞分化起着重要的作用。