黄颡鱼GH/IGF生长轴基因的序列特征和两性表达差异分析

摘要

两性生长异形常见于水产养殖鱼类中，例如黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)，雌雄生长速率差异显著，雄鱼个体大生长快，而雌鱼个体小生长慢。生长激素和类胰岛素生长因子轴（GH/IGF轴）是调节脊椎动物个体生长的主要激素系统，其重要的信号因子包括生长激素(GH)，类胰岛素生长因子1（IGF-1）和类胰岛素生长因子2(IGF-2)。本实验为研究黄颡鱼雌雄生长差异的分子机制，拟通过克隆黄颡鱼GH/IGF轴相关基因，检测GH，IGF-1，IGF-2基因在成鱼下丘脑-垂体-肝脏轴中的表达分布，并采用荧光定量的方法对幼体发育时期雌雄鱼的GH/IGF轴相关基因表达进行分析。另外，脊椎动物雌雄生长差异还受到性类固醇激素水平的影响，拟通过以卤虫为17α-甲基睾酮(MT)载体，饲喂幼体发育时期黄颡鱼，检测GH/IGF轴基因表达，分析性类固醇激素对雌雄鱼生长的影响。主要结果如下:
　　1、黄颡鱼GH基因的cDNA长度为1088bp，其ORF序列603bp。推导的氨基酸序列包含1个信号肽和GH结构域。黄颡鱼IGF-1基因的cDNA序列为547bp，编码145个氨基酸。其氨基酸序列由1个信号肽和IGF结构域组成。黄颡鱼IGF-2基因的cDNA为876bp，包含759 bp的编码区，编码252个氨基酸。推导的氨基酸序列由1个信号肽、IGF域和IGF-2 E-peptide域组成。系统进化树结果显示，黄颡鱼GH聚于硬骨鱼类的进化支，且被分在鲶形目这支上，具有较高支持率。IGF-1和IGF-2进化树分别显示出2个分支，在分支中，IGF-1和IGF-2具有高度相似性，在硬骨鱼类的进化支上，黄颡鱼和其他鲶形目物种聚在一起，并且具有高支持率。
　　2、这三个基因在检测的组织中广泛表达。GH基因主要在垂体表达，而垂体外组织表达较低。IGF-1基因大部分在肝脏中表达，随后是下丘脑、垂体和性腺。IGF-2基因主要在肝脏中表达，在下丘脑和垂体中的表达量相对较低。这表明GH主要分泌部位为垂体，IGF-1和IGF-2为肝脏。
　　3、GH mRNA在雌性稚鱼孵化后第1-3周的表达水平相对稳定，在第4周开始上升。相比之下，雄性稚鱼在第1-4周逐渐增高。IGF-1 mRNA在第1-4周的表达水平在雌性和雄性中都逐渐升高。雌性稚鱼IGF-2 mRNA表达量在第2周稍微增加，在第3周下降，在第4周又回升到与第2周相似的表达水平。然而，雄性稚鱼IGF-2 mRNA的表达水平在第1-3周一直升高，在第4周稍微下降。有趣的是，在稚鱼生长阶段，GH、 IGF-1和IGF-2基因在雄鱼中的表达量明显高于雌鱼。这表明GH\IGF轴关键基因的差异表达对两性生长异形有一定的影响。
　　4、在雌性幼鱼中，与对照组相比，MT处理激活了GH/IGF轴基因的表达水平。GH基因在处理后1周受到刺激，在第3周升高到一个更高的水平。IGF-1基因在第2周受到刺激，在第3周下降，然后在第4周保持在一个相对稳定的水平。除此之外，IGF-2基因在第2周受到刺激，在第3周一直增长，随后第4周下降。在雄性幼鱼中，对照组幼鱼发育阶段GH和IGF-1的表达量逐渐升高。在MT处理组，虽然GHmRNA表达量在所有时期都远低于对照组，但是有逐渐升高的趋势。IGF-1 mRNA的表达水平在第2周升高，在第3周下降，然后在第4周升高。但是与对照组相比，它的表达水平由于MT处理而下降。IGF-2 mRNA的表达水平在第2周，MT处理组和对照组均升高。但是在第3周经MT处理表达水平降低。这暗示出性激素对雌雄鱼GH\IGF轴的基因的表达调控可能会引起雌雄生长差异。

目录

声明

摘要

缩略语表

第一章 前言

1 研究问题的由来

2 GH／IGF生长轴在鱼类生长中的研究进展

2．1 生长激素(GH)的研究进展

2．2 胰岛素生长因子(IGF)的研究进展

3 鱼类中的两性异形研究进展

4 性激素对GH／IGF轴基因表达的影响

5 本研究的目的和意义

第二章 材料与方法

1 实验材料

1．1 实验用鱼及样品采集

1．2 人工繁殖及生长期样品采集

1．3 激素处理用鱼及样品采集

2 实验主要仪器设备及耗材

2．1 实验主要仪器设备

2．2 试剂盒、主要试剂

2．3 主要试剂的配制

3 实验方法

3．1 基因组DNA的提取与检验

3．2 总RNA提取与检验

3．3 cDNA第一链的合成

3．4 引物设计与PCR扩增

3．5 黄颡鱼稚鱼雌雄鉴定

3．6 PCR产物回收与纯化

3．7 连接转化与阳性克隆的筛选

3．8 序列分析

3．9 实时荧光定量PCR

3．10 数据分析

第三章 结果分析

1 序列分析

1．1 黄颡鱼GH，IGF-1，IGF-2基因编码氨基酸序列比对分析

1．2 黄颡鱼GH，IGF-1，IGF-2基因序列的进化分析

2 GH／IGF轴相关基因在黄颡鱼成体组织中的表达分布

3 GH／1GF轴相关基因在黄颡鱼雌雄稚鱼发育时期的表达

3．1 黄颡鱼雌雄稚鱼基因型的鉴定

3．2 黄颡鱼雌雄稚鱼发育时期GH／IGF轴相关基因的表达

4 黄颡鱼稚鱼发育时期17α-甲基睾酮(MT)对GH／IGF轴相关基因表达的影响

4．1 17α-甲基睾酮对黄颡鱼雌稚鱼GH／IGF轴相关基因表达的影响

4．2 17α-甲基睾酮对黄颡鱼雄性稚鱼GH／IGF轴相关基因表达的影响

第四章 讨论

1 序列分析

2 GH／IGF轴相关基因在不同鱼类中的组织表达分布

3 GH／IGF轴相关基因在雌雄稚鱼发育时期的表达

4 雌雄稚鱼发育时期MT对GH／IGF轴相关基因表达的影响

参考文献

论文发表情况

待整理文章

致谢