内质网应激在铜差异性影响黄颡鱼和虾虎鱼脂代谢中的作用及其机制

摘要

内质网(ER)是一个担负重要生理功能的细胞器，不仅担负着蛋白质正常的合成折叠和运输，而且还承担着甘油三酯和胆固醇的合成以及细胞内钙离子的储存。当细胞受到体内外的刺激时，内质网中将出现未折叠蛋白或错误折叠蛋白的积聚，从而导致内质网发生不同程度的内质网应激(ER Stress)，并激活其下游信号通路——未折叠蛋白反应(UPR)。近年来，人们对ER Stress及其介导的信号通路的剖析已经取得了重要进展，发现了一些关键基因和蛋白，也查明了信号通路;同时，最近研究也表明ER Stress及其介导的信号通路在脂类代谢中发挥了重要作用。然而，这些研究大都是在陆生哺乳动物开展的，有关鱼类中ER Stress及其介导的信号通路知之甚少。
　　铜是鱼类必需的微量元素之一，作为多种酶的辅助因子及一些蛋白的组成部分，广泛参与鱼体内的生理生化过程。前期研究已经表明铜（经由水体和/或饲料途径）可对鱼类脂肪沉积及代谢产生影响。然而，目前我们实验室连同国际上一些其他的实验的工作仍局限于铜影响下与鱼类脂类代谢直接相关酶活性及基因表达的变化情况。对于铜元素影响脂类代谢上游调控通路的情况认识较少。考虑到ER Stress及其介导的信号通路在脂类代谢中扮演重要角色，推断ER Stress及其介导的信号通路在铜差异性影响不同鱼类脂代谢过程中同样发挥着重要的作用。然而，迄今为止，在鱼类中有关此类研究仍未见报道。本研究以黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）和虾虎鱼（Synechogobius hasta）为研究对象，首先克隆得到了一些内质网应激基因的cDNA全长序列，并在此基础上进一步探讨了ER Stress及其介导的信号通路在铜差异性影响这两种鱼脂代谢过程中的作用及机制，主要分为以下3个部分内容:
　　第一部分黄颡鱼和虾虎鱼内质网应激基因的分子克隆及组织表达分析
　　利用简并引物，采用RACE技术分别从黄颡鱼和虾虎鱼中获得了5条ER Stress相关基因的cDNA全长序列，包括葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、钙网蛋白(CRT)、双链RNA依赖的蛋白激酶样ER激酶(PERK)、跨膜蛋白激酶（IRE）-1α和真核翻译起始因子(ATF)-6α。其中，在黄颡鱼中，该5种基因全长序列分别为2544 bp、1678 bp、3776 bp、3440 bp和2785 bp，分别编码652、418、1080、1038和657个氨基酸;在虾虎鱼中，该5种基因全长序列分别为2477bp、1953bp、4050 bp、4095bp和2845 bp，分别编码652、419、1106、1027和645个氨基酸。同源性分析的结果显示，在黄颡鱼中，这五种基因与斑马鱼（Danio rerio）、青鳉（Oryzias latipe）、人（Homo sapiens）及爪蟾（Xenopus tropicalis）等其他物种的氨基酸同源性为40.4％-94.9％;在虾虎鱼中，这5种ER Stress相关基因与斑马鱼（Danio rerio）、小鼠（Rattus norvegicus）、人（Homo sapiens）及爪蟾（Xenopus tropicalis）等其他物种的氨基酸同源性为41.5％-97.8％。进化树分析结果进一步证明了黄颡鱼和虾虎鱼的进化地位。预测其蛋白结构的结果表明，该5种ER Stress基因在黄颡鱼和虾虎鱼中均包含如KDEL基序、信号肽序列、传感器域和效应者结构域等结构域。
　　通过荧光实时定量PCR技术，研究了黄颡鱼和虾虎鱼GRP78、CRT、PERK、IRE-1α及ATF-6α在不同组织中的基因表达水平。结果显示，这5种ER Stress基因在黄颡鱼和虾虎鱼所有被检测组织中均有表达，且均在肝脏组织中有较高的表达量。
　　第二部分铜对黄颡鱼和虾虎鱼内质网应激及其介导的信号通路的影响
　　2.1.水体铜暴露对黄颡鱼内质网应激及其介导的信号通路的影响
　　本实验是在铜离子浓度分别为对照、30μg Cu/L和60μg Cu/L的水体中对黄颡鱼进行的暴露实验，并分别于28天和56天取肝脏组织进行分析，研究水体铜暴露对黄颡鱼肝脏内内质网超微结构、ER Stress及其介导的信号通路的影响。结果显示，在28天时，GRP78、GRP94、CRT、PERK、eIF2α、IRE-1α和XBP-1基因的mRNA表达水平有所升高。而在58天时，随着水体铜浓度的上升，GRP78、GRP94、CRT、PERK、eIF2α、IRE-1α、XBP-1和ATF-6α基因的表达水平则有所下降，表明水体铜暴露诱导黄颡鱼肝脏内产生了ER Stress反应，且该现象具有时间依赖性效应;同时，也表明水体铜暴露激活了两条UPR通路，既PERK-eIF2α和IRE1-XBP1通路。黄颡鱼肝脏细胞内的内质网超微结构也进一步证实了上述结论。
　　ER是细胞内最大的钙库，ER Stress与钙离子(Ca2+)有着不可分割的关系，细胞内Ca2+浓度失调是ER Stress众多的表面形式之一。因此，为探究铜诱导黄颡鱼肝细胞产生ER Stress所通过的细胞内钙动员通路，本实验利用荧光探针Fluo-4/AM结合激光共聚焦显微镜技术测定了黄颡鱼肝细胞内钙离子浓度。结果显示，铜孵育显著增加了肝细胞内钙离子的浓度。同时，通过添加内质网膜上钙通道的特异性拮抗剂（IP3特异性抑制剂2-APB和RyR特异性抑制剂（dantrolene），结果显示铜离子通过动员释放内质网中的钙离子，而造成细胞质中钙离子浓度的快速升高，表明细胞中钙离子稳态的失衡是铜诱导产生ER Stress反应的重要原因。
　　2.2.饲料铜缺乏和过量对黄颡鱼内质网应激及其介导的信号通路的影响
　　为了研究饲料铜缺乏和过量对黄颡鱼肝脏和肌肉组织中ER Stress及其介导的信号通路的影响及其机理，黄颡鱼分别饲喂三种不同铜水平(铜缺乏(0.76 mg/kg)、适量铜(4.18 mg/kg)和铜过量(92.45 mg/kg))的饲料8周。结果显示，在肝脏组织中，铜过量显著上调了GRP78、CRT、PERK、eIF2α、IRE-1α和XBP-1基因的表达水平;但铜缺乏只上调了CRT的mRNA表达水平。在肌肉组织中，铜过量显著地上调了GRP78、CRT和XBP-1基因的表达水平，而对其他基因的表达水平没有显著影响。铜缺乏对所有检测基因的表达水平均没有显著影响。因此，本实验表明饲料铜过量可以引起黄颡鱼体内的ER Stress反应，并激活了PERK-eIF2α和IRE1-XBP1通路，且该现象呈现组织特异性。
　　2.3.水体铜暴露对虾虎鱼内质网应激及其介导的信号通路的影响
　　在本研究中，虾虎鱼分别暴露于对照、18μg Cu/L、38μg Cu/L和55μg Cu/L四种不同铜离子浓度的水体中，并分别于30天和60天取肝脏组织进行分析，研究水体铜暴露对虾虎鱼ER Stress及其介导的信号通路的影响。结果显示，在30天时，水体铜暴露显著提高了两种ER Stress相关标志物(GRP78和CRT)及UPR信号途径中几种关键基因(PERK、eIF2α、IRE-1α、XBP-1和ATF-6α)的表达量，表明水体铜暴露诱导虾虎鱼肝脏组织内发生了ER Stress反应，并进一步激活了UPR信号通路。在60天时，GRP78、CRT、PERK、eIF2α、IRE-1α、XBP-1和ATF-6α基因的mRNA水平在18μg Cu/L和38μg Cu/L暴露组中有所上升。而在55μg Cu/L暴露组中，这些ER Stress基因的表达水平则有所下降，此结果与在30天时观察到的结果正好相反，表明水体铜暴露在虾虎鱼肝脏内诱导的ER Stress反应及UPR信号通路的激活具有时间和浓度依赖性效应。
　　同样，为探究铜诱导虾虎鱼肝细胞产生ER Stress所通过的细胞内钙动员的通路，探究了铜孵育对虾虎鱼肝细胞内质网钙离子稳态的影响。结果表明铜孵育可以引起虾虎鱼肝细胞细胞质内钙离子浓度的升高。内质网膜上钙离子通路特异性抑制剂的添加，查明了内质网中钙离子的流失是铜诱导细胞质中钙离子升高的原因，同时也表明钙离子稳态的失衡在铜离子诱导的ER Stress反应的重要原因。
　　第三部分内质网应激及其介导的信号通路在铜影响黄颡鱼和虾虎鱼脂肪沉积及脂代谢中的作用及其机制
　　3.1.内质网应激及其介导的信号通路在铜影响黄颡鱼脂肪沉积及SREBP-1c活化过程中的作用及部分机制
　　首先，本实验将黄颡鱼分别暴露于三种铜浓度（对照、30μg Cu/L和60μg Cu/L）的水体中，并分别于28天和56天取肝脏组织进行分析，研究水体铜暴露对黄颡鱼肝脏脂肪沉积及SREBP-1c通路的影响。结果显示，在28天时，随着水体铜浓度的上升，肝脏内脂肪含量、脂肪酸合成酶(FAS)活性，以及SREBP-1c通路相关基因（SREBP-1c、SCAP、ACCα和FAS）的表达水平均有所升高。在56天时，随着水体铜浓度的升高，肝脏脂肪含量、脂肪酸合成酶(FAS)的活性，以及SREBP-1c通路相关基因（SREBP-1c、ACCα和FAS）的表达水平均有所降低。组织切片和油红O染色的结果也进一步证实上述结论。本研究表明了水体铜暴露可以通过活化SREBP-1c而影响进而影响黄颡鱼肝脏内脂肪的沉积。
　　然后，为深入了解ER Stress及其介导的信号通路在铜影响黄颡鱼脂代谢过程中的作用机制，我们探讨了离体条件下，铜离子的单独孵育及ER Stress抑制剂（4-苯基丁酸，4-PBA）对黄颡鱼原代肝细胞ER Stress及其介导的信号通路的影响，以及由此对脂肪沉积及SREBP-1c通路产生的影响。结果显示，铜离子单独孵育的条件下，GRP78、GRP94、CRT、PERK、eIF2α、IRE-1α和XBP-1基因的表达水平均有所升高，同时，SREBP-1c通路相关基因（SREBP-1c、SCAP、ACCα和FAS）的mRNA表达水平也随之升高。相对于单独铜孵育组，4-PBA的添加显著降低了GRP78、GRP94、CRT、PERK、eIF2α、IRE-1α和XBP-1的mRNA水平;4-PBA也显著降低了SREBP-1c、SCAP、ACCα和FAS的mRNA水平，进而降低了肝脏细胞内甘油三酯(TG)的含量。研究表明，ER Stress及其介导的信号通路在铜影响黄颡鱼脂肪沉积及SREBP-1c活化过程中发挥着重要作用。
　　3.2.内质网应激及其介导的信号通路在铜激活虾虎鱼SREBP-1c通路过程中的作用及部分机制
　　本研究以虾虎鱼的原代肝脏细胞为模型，探讨了铜离子的单独孵育及4-PBA的添加对肝细胞ER Stress及其介导的信号通路产生的影响，以及由此对SREBP-1c通路产生的影响。结果显示，铜离子单独孵育显著上调了GRP78、CRT、PERK、eIF2α、IRE-1α、XBP-1和ATF-6α基因的表达水平;铜离子单独孵育也上调了SREBP-1c通路相关基因（SREBP-1c、SCAP、ACCα、SCD-1和FAS）的mRNA表达水平及FAS活性。4-PBA显著抑制了由铜离子诱导的ER Stress现象，并由此缓解铜离子对SREBP-1c的活化作用，进而降低了肝细胞内FAS活性及TG的含量。研究表明，ER Stress及其介导的信号通路在铜影响虾虎鱼肝细胞内脂肪沉积及SREBP-1c活化过程中扮演着重要角色。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1 内质网应激(ER Stress)及其介导的信号通路的研究进展

1．1 ER Stress与未折叠蛋白反应(UPR)

1．2 ER Stress介导的信号通路

1．3 钙离子信号通道及其与ER Stress的关系

2 ER Stress及其介导的信号通路对脂代谢影响的研究进展

2．1 ER Stress通过激活SREBP-1c而直接调控脂类代谢

2．2 ER Stress通过调控脂类代谢相关因子的转录水平影响脂类代谢

2．3 ER Stress反应通过调节ApoB影响脂类的分泌

3 关于铜对鱼类影响的研究进展

3．1 铜对鱼类的生理及其毒性作用

3．2 铜对鱼类脂代谢的影响

4 本研究的目的及意义

第二章 黄颡鱼和虾虎鱼内质网应激(ER Stress)基因的克隆及组织表达分析

第一节 黄颡鱼ER Stress基因的克隆及组织表达分析

1 前言

2 材料与方法

3 结果与分析

4 讨论

第二节 虾虎鱼ER Stress基因的克隆及组织表达分析

1 前言

2 材料与方法

3 结果与分析

4 讨论

第三章 铜对黄颡鱼和虾虎鱼内质网应激及其介导的信号通路的影响

第一节 水体铜暴露对黄颡鱼内质网超微结构、内质网应激及其介导的信号通路的影响

1 前言

2 材料与方法

3 结果与分析

4 讨论

第二节 饲料铜缺乏和过量对黄颡鱼内质网应激及其介导的信号通路的影响

1 前言

2 材料与方法

3 结果与分析

4 讨论

第三节 水体铜暴露对虾虎鱼内质网应激及其介导的信号通路的影响

1 前言

2 材料与方法

3 结果与分析

4 讨论

第四章 内质网应激及其介导的信号通路在铜影响黄颡鱼和虾虎鱼脂肪沉积及代谢中的作用及其机制

第一节 内质网应激及其介导的信号通路在铜影响黄颡鱼脂肪沉积及活化SREBP-1c过程中的作用及部分机制

1 前言

2 材料与方法

3 结果与分析

4 讨论

第二节 内质网应激及其介导的信号通路在铜影响虾虎鱼脂肪沉积及SREBP-1c活化过程中的作用及部分机制

1 前言

2 材料与方法

3 结果与分析

4 讨论

全文总结

参考文献

一、作者简介

二、研究生期间发表论文情况

三、研究生期间获得的奖励和荣誉

四、研究生期间参加学术会议情况

致谢