牦牛几种腹泻相关因素研究及其呼吸道疾病血清学调查

摘要

牦牛因对青藏高原地带严寒、缺氧、缺草等恶劣条件具有良好的适应能力而成为高寒牧区最重要的生产生活资料，其生态、社会、经济地位不可替代。但由于农牧民粗放的掠夺式经营管理，牦牛严重的近亲繁殖，致使草场退化，沙化严重，畜群结构不合理以及牦牛品种退化，所以近年来牦牛尤其是犊牦牛各种疾病的发病率逐年升高。犊牦牛腹泻是临床上最为常见的多发病，也是影响犊牦牛繁活率的主要因素之一。引起犊牦牛腹泻的因素比较复杂，主要与犊牦牛生理功能、营养、应激、及病原微生物的侵袭等有关。该病的发生严重影响着犊牦牛的生长发育以及成年后的生产性能，给高原地区牦牛养殖业造成了不容忽视的经济损失。故本实验主要在微量元素及犊牦牛肠道菌群与腹泻的关系、引起犊牦牛腹泻的主要病原及牦牛主要呼吸道疾病血清流行病学等方面展开研究和调查，并取得如下结果:
　　1.牦牛腹泻与微量元素铜、铁、锌、硒、锰关系的研究
　　选择10头健康牦牛和25头腹泻牦牛，采用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)测定每头牦牛血清中Cu、Fe、Mn、Zn、Se微量元素含量。比较健康组和腹泻组牦牛血清中Cu、Fe、Mn、Zn、Se元素含量的水平;比较牦牛腹泻组不同年龄阶段血清中Cu、Fe、Mn、Zn、Se元素含量的水平。结果腹泻组Fe、Mn、Zn水平均显著低于健康对照组，Cu水平显著高于健康对照组，Se水平差异不显著;腹泻组中≤1月龄牦牛血清中Zn，Mn元素水平显著高于≥2年龄牦牛，Cu、Fe、Se含量不显著。腹泻牦牛血清Fe、Mn、Zn微量元素水平偏低，且与年龄有相关性。
　　2.腹泻犊牦牛与健康犊牦牛肠道菌群的差异研究
　　本试验以健康犊牦牛和腹泻犊牦牛新鲜粪样为研究对象，通过对细菌16S rDNAV3-V4区高通量测序比较了腹泻犊牦牛和健康犊牦牛肠道菌群数量差异及菌群结构变化。结果共获得了272071条优化序列，经鉴定细菌来源9个门，13个纲，17个目，36个科，72个属。腹泻犊牦牛肠道菌群的菌种数目低于健康组，但多样性比较没有显著性差异;但两组菌群结构比较，在门、纲、目、科及属水平上皆有显著性。本研究表明犊牦牛腹泻与肠道菌群结构改变存在一定的相关性。
　　3.牦牛源大肠杆菌的分离鉴定及其相关毒力基因检测
　　本研究于2014年6月到8月从红原地区无菌采集50头临床腹泻犊牦牛肛拭子，对其分离纯化培养、生化鉴定，并对大肠杆菌分离株进行O血清型测定、小鼠致病性实验、16SrRNA测序及毒力基因检测。试验结果显示，通过分离培养及生化试验共鉴定出47株大肠杆菌;通过玻片凝集鉴定出12种O血清型，覆盖37株分离株，另有10株未定型，其优势血清为O125、O145和O91;分离菌株腹腔注射小鼠均致病，剖检可见明显病变;随机挑选12株分离株进行16SrRNA测序，经系统发育分析发现分离菌株组内同源性为99.7％～100％，与Genbank中其他菌株的同源性为94％～98％;通过PCR方法检测犊牦牛源大肠杆菌毒力基因，其中iss、fimH、OmpA、papC、traTa、tsh、iucD和ETT2在犊牦牛源大肠杆菌的检出率分别为65.2％、21.7％、91.3％、34.8％、8.7％、34.8％、30.4％、65.2％, KspⅡ、cva均为4.3％, STa、irp2均未检出。表明，犊牦牛源大肠杆菌血清型比较复杂，并携带多种毒力基因。
　　4.犊牦牛源致病性大肠杆菌全基因组测序分析
　　本实验测序结果原始数据为6.92 G，过滤数据后数据量为6.89 G，测序深度分别为1384X和1378 X，测序质量满足后续分析要求;使用velvet进行不同kmer的基因组组装，最优组装结果的contig n50为52203 bp，使用SSPACE_ Standard进一步构建scaffold以及GapCloser局部组装补洞之后得到的contig和scaffold的n50达到了130308 bp和354007 bp，最后得到的基因组大小为5.3 M，预测的基因模型为5438个，数量级上符合大肠杆菌全基因组5M左右的背景预期。以大肠杆菌参考基因组序列(NCBI下载的完成图)为依据，使用Mauve Contig Mover软件对velvet组装的scaffold进行定位，得到每条scaffold之间的order信息之后，使用200个n将scaffold连接成一条完整的线性染色体。并对线性染色体进行基因预测，找到了5543个蛋白编码基因，10个rRNA和92个tRNA，接着对大肠杆菌基因组进行了重复序列、基因岛、前噬菌体预测，并对蛋白编码基因进行了NR、Swiss-prot、COG、KEGG、GO功能注释。
　　5.牦牛主要呼吸道疾病的血清学调查
　　应用酶联免疫吸附试验（ELISA）对在2011年间采自西藏的938份和青海的206份共1144份牦牛血清进行结核杆菌抗体检测，同时对采自西藏988份、青海475份和四川377份共1840份牦牛血清进行牛传染性鼻气管炎病毒抗体检测。结果检出结核杆菌阳性血清样品西藏阳性率2.56％，青海阳性率0.98％;检出牛传染性鼻气管炎阳性血清样品西藏阳性率38.6％;青海阳性率44.6％及四川阳性率27.9％。统计数据表明牛结核杆菌和牛传染性鼻气管炎病毒在青藏高原部分地区牦牛群中均流行。
　　综上所述，本实验通过对腹泻相关的因素及主要呼吸道疾病的流行病学调查的研究，较全面的了解引起犊牦牛腹泻疾病的原因及两种流行病的感染情况，并通过对致病性大肠杆菌的分离鉴定及全基因测序，进一步明确了主要病原体的生物学特性。本研究的结果将为犊牦牛腹泻性疾病及主要的呼吸道疾病防治提供数据参考，同时为进一步犊牦牛腹泻疾病疫苗的研发提供理论依据。

目录

声明

摘要

缩略词表(abbreviation)

第一部分 文献综述

1 我国牦牛产业概况

1．1 牦牛的分布

1．2 牦牛对藏族人民的重要意义

1．3 我国牦牛的发展现状

2 犊牦牛腹泻发病原因及病原概述

2．1 常见微量元素的生理功能

2．2 犊牛消化道微生物菌群

2．3 大肠杆菌病原学生物特性

3 牛结核病和牛分枝杆菌

3．1 牛结核病病原学

3．2 牛结核病流行病学

3．3 牛结核病的分布及危害

3．4 牛结核病诊断方法

3．5 免疫预防

3．6 公共卫生

4 牛传染性鼻气管炎简介

4．1 病原学

4．2 牛传染性鼻气管炎的流行病学及危害

4．3 牛传染性鼻气管炎临床症状

4．4 牛传染性鼻气管炎的诊断

4．5 牛传染性鼻气管炎的防治

第二部分 试验部分

第一章 牦牛腹泻与微量元素铜、铁、锌、硒、锰关系的研究

1 研究背景

2 材料与方法

3 结果

4 分析与讨论

第二章 腹泻犊牦牛与健康犊牦牛肠道菌群的差异研究

1 研究背景

2 材料和方法

3 结果与分析

4 分析讨论

第三章 牦牛源大肠杆菌的分离鉴定及其相关毒力基因检测

1 研究背景

2 材料与方法

3 结果

4 讨论与分析

第四章 犊牦牛源大肠杆菌比较基因组学分析

1 研究背景

2 材料与方法

3 信息分析结果

4 分析与讨论

第五章 牦牛主要呼吸道疾病的血清学调查

1 研究背景

2 材料与方法

3 检测结果

4 分析与讨论

全文结论

参考文献

致谢

博士期间发表的文章

证书与奖励