神经肽Y(NPY)及其受体在母鸡生殖道的分布研究

摘要

在母鸡输卵管子宫阴道交接部及漏斗部存在一特殊的管状腺，能够使鸡精子长期存活并保持受精能力，因其具有长期贮存精子的能力，而被称为贮精腺，前期研究表明，NPY基因是禽类子宫阴道交接部的差异表达基因，推测母鸡生殖道中的NPY可能参与调控精子活力。
　　本试验利用免疫组织化学法检测NPY、NPY受体(NPY1R和NPY5R)在产蛋期母鸡生殖道的分布，结果表明NPY和NPY1R在母鸡生殖道的表达比较一致，NPY和NPY1R在漏斗部、峡部、膨大部及子宫的粘膜上皮均有表达，且NPY在漏斗部粘膜上皮阳性信号最强，其次为膨大部和峡部，而NPY1R在膨大部和峡部粘膜上皮的阳性信号最强。
　　用鸡NPY及其受体NPY1R和NPY5R的保守区设计特异性引物，内参基因选择鸡β-actin基因，利用荧光定量分析鸡NPY基因及其受体NPY1R、NPY5R在母鸡输卵管漏斗部、膨大部、峡部、子宫、子宫阴道交接处及阴道的表达。结果发现，NPY在峡部及阴道部的表达量显著高于输卵管其他部位(P＜0.05); NPY1R在阴道部的表达量显著高于输卵管其他部位(P＜0.05); NPY5R在子宫阴道交接部和阴道的表达量显著高于输卵管其他部位（P＜0.05）。
　　根据GenBank上公布的鸡NPY序列合成符合毕赤酵母密码子偏好性的NPY基因，并连接至真核表达载体pPICZαA中，将重组质粒电转至毕赤酵母菌GS115中，用终浓度为1％的甲醇进行诱导表达，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SD S-PAGE)和Western Blot检测，结果表明重组酵母菌成功分泌鸡NPY蛋白，大小约为35kDa。

目录

声明

摘要

缩略词表(Abbreviation)

1 文献综述

1．1 神经肽Y(NPY)及其受体研究进展

1．1．1 NPY的研究进展

1．1．2 NPY1R的研究进展

1．1．3 NPY5R的研究进展

1．2 毕赤酵母表达系统的研究进展

1．2．1 蛋白表达系统

1．2．2 酵母表达系统

1．2．3 巴斯德毕赤酵母表达系统

1．3 本研究的目的和意义

2 NPY及其受体在母鸡生殖道的表达

2．1 前言

2．2 试验材料

2．2．1 试验动物

2．2．2 主要药品及试剂

2．2．3 常用试剂的配制

2．2．4 主要仪器

2．3 试验方法

2．3．1 石蜡包埋

2．3．2 制备石蜡切片

2．3．3 免疫组化步骤

2．4 结果分析

2．5 讨论

3 NPY及其受体在母鸡输卵管不同部位的表达

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．2．1 试验材料

3．2．2 试验方法

3．3 结果分析

3．3．1 总RNA的提取与检测

3．3．2 NPY基因PCR条件的确定

3．3．3 NPY1R基因PCR条件的确定

3．3．4 NPY5R基因PCR条件的确定

3．3．5 NPY基因荧光定量结果

3．3．6 NPY1R基因荧光定量结果

3．3．7 NPY5R基因荧光定量结果

3．4 讨论

4 NPY在毕赤酵母中的表达

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．2．1 材料

4．2．2 试验方法

4．3 结果与分析

4．3．1 重组表达质粒的构建

4．3．2 重组质粒线性化检测

4．3．3 阳性转化子的PCR鉴定

4．3．4 Tricine-SDS-PAGE和Western Blot检测结果

4．3．5 蛋白浓度检测结果

4．4 讨论

5 结语

5．1 全文总结

5．2 进一步研究内容

参考文献

附录

致谢