蒺藜苜蓿维生素E合成相关基因MtHPT1与MtTMT的克隆及其功能验证

摘要

天然维生素E（Vitamin E）是一类与人类健康、动物饲养息息相关的一类植物次级代谢产物，主要存在于油料作物中。在蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)中，维生素E的的代谢途径所涉及的研究有限，MtHPT1与MtTMT参与维生素合成的蒺藜是尚不清楚。本研究以蒺藜苜蓿为研究材料，分离并克隆出MtHPT1与MtTMT，构建表达载体，利用根癌农杆菌介导转化拟南芥的植株，验证了MtHPT1与MtTMT基因的功能。主要研究结果如下：
　　1、克隆出MtHPT1与MtTMT，将其转入表达载体中，并转入到拟南芥野生型及突变体中。MtHPT1过表达野生型拟南芥，使T2代种子中生育酚总含量比Col-0型拟南芥提高21％-33%。MtTMT过表达野生型拟南芥，使T2代种子中α-生育酚在总生育酚的比例从3.2%达到7.1%-66.3%。MtTMT互补了拟南芥突变体vte4-3、vte4-4，使其叶片中α-生育酚缺失性状得到恢复。
　　2、对蒺藜苜蓿中MtHPT1与MtTMT在不同的组织中的表达量进行了分析，发现在叶片中两个基因的表达量均比较高，在根中的表达量最低。
　　3、分析了在苜蓿叶片中MtHPT1与MtTMT在NaCl胁迫、冷胁迫、热胁迫条件下的表达模式及维生素E含量的变化。在胁迫处理下，MtHPT1与MtTMT的表达量变化趋势相似；在冷胁迫下，表达量呈现一直下降的趋势；在NaCl处理下，表达量呈现先下降再升高的趋势；在热胁迫条件下，表达量呈现先下降，后升高，再下降的趋势。只有在热胁迫及NaCl胁迫的情况下维生素E的含量有小幅度升高，在冷处理下，维生素E的含量变化不大。
　　4、筛选出了蒺藜苜蓿tmt纯合突变体、并观测了部分性状。相比于野生型蒺藜苜蓿R108，tmt在种子、叶片、果荚、生育酚含量等性状上表现出很大的不同。主要特征有：tmt突变体生育期比R108要长2个星期左右；tmt叶片较大，三叶中上叶的叶柄较长；在幼苗期，tmt植株四叶及五叶的现象出现的频率较高；在tmt种子及叶片中，几乎检测不到α-生育酚等。

目录

声明

缩略语表

1.文献综述

1.1 豆科模式植物蒺藜苜蓿

1.1.1蒺藜苜蓿简介

1.1.2 Tnt1插入蒺藜苜蓿突变体库介绍

1.2维生素E的研究进展

1.3维生素E的合成途径

1.3.1 HPPD

1.3.2 HPT

1.3.3 MPBQ MT

1.3.4 TC

1.3.5γ-TMT

1.4 本研究的目的及意义

2.实验材料与方法

2.1实验材料

2.1.1植物材料

2.1.2实验菌株及载体

2.1.3主要试剂

2.1.4主要仪器

2.1.5引物合成

2.2实验方法

2.2.1生物信息学分析

2.2.2基因克隆

2.2.3载体构建与转化

2.2.4含目的基因表达载体质粒的大肠杆菌DH5α的培养及质粒提取

2.2.5农杆菌介导的拟南芥转化

2.2.6转基因阳性拟南芥的筛选

2.2.7维生素E的提取

2.2.8蒺藜苜蓿突变体的鉴定

2.2.9维生素E含量的检测

2.2.10 蒺藜苜蓿逆境处理

3.结果与分析

3.1 Mt HPT1的基因功能验证

3.1.1 MtHPT1的生物信息学分析

3.1.2 MtHPT1组织特异性表达

3.1.3逆境处理下MtHPT1表达量分析

3.1.4 MtHPT1 转野生型拟南芥阳性植株的筛选

3.1.5拟南芥转化结果分析

3.2 MtTMT基因功能验证

3.2.1 生物信息学分析

3.2.2 MtTMT的组织特异性表达分析

3.3.3 胁迫处理下MtTMT在蒺藜苜蓿叶片中表达量分析

3.2.4 MtTMT转野生型拟南芥结果分析

3.2.5 MtTMT转拟南芥突变体vte4-3结果分析

3.2.6 MtTMT转拟南芥突变体vte4-4结果分析

3.3 蒺藜苜蓿tmt突变体的筛选与性状观察

3.3.1蒺藜苜蓿突变体的生物信息学分析

3.3.2蒺藜苜蓿tmt突变体的筛选

3.3.3 tmt蒺藜苜蓿突变体表型观察

3.3.4 tmt和R108胁迫处理

4.讨论

参考文献

6.Prtocols

Protocols1.CTAB 法提取植物组织DNA

Protocols2.大肠杆菌DH5α感受态制备

Protocols3.农杆菌GV3101 感受态制备

7.附表

致谢