重组毕赤酵母产Lunasin发酵工艺及Lunasin生物活性研究

摘要

Lunasin是一个最初从大豆中分离，含有43个氨基酸，分子量为5 kDa，具有抗氧化、抗炎症、抗癌症、降血脂功能的多肽。
　　本文对一株毕赤酵母工程菌高产Lunasin的发酵工艺和膜分离纯化条件，以及降血脂活性进行了研究。主要研究结果如下:
　　(1)菌株生长特性研究。以OD600为指标，确定了该毕赤酵母在YPG培养基中的生长曲线，确定其一级种子液和二级种子液培养最适时间分别为28 h和20h。以蛋白表达量为指标确定山梨醇添加量为40 g/L，甘露醇添加量为20g/L。
　　(2)高密度发酵工艺优化。比较了溶氧反馈补料和指数-恒速补料两种补料方式，溶氧反馈补料Lunasin最高表达量为0.889 g/L，指数-恒速补料最高表达量为1.805 g/L;诱导温度为24℃条件下表达量最高，为2.57 g/L;比较了诱导期单一碳源与双碳源（甲醇-山梨醇，甲醇-甘露醇）补料策略，发现甲醇-甘露醇混合补料更有利于提高Lunasin的表达，最高表达量达到3.02 g/L;甲醇-复合氮源混合补料最高表达量达到3.26 g/L，是最初Lunasin表达量的3.67倍。
　　(3)膜分离工艺优化。研究了Vivaflow200超滤膜包的两级膜过滤来提纯Lunasin并提高回收率的条件。结果表明一级膜过滤最优条件为进料压力0.2MPa，pH8.5，发酵液温度40℃，添加0.6倍原体积超纯水稀释，回收率达到0.9412;二级膜过滤最优条件为进料压力0.25 MPa，pH5.5，发酵液温度30℃，稀释倍数为625倍，回收率为0.7895。两级超滤分离后综合回收率为0.7396。
　　(4) Lunasin降血脂活性研究。通过高脂饲料饲喂SD大鼠构建高血脂模型，探讨Lunasin对大鼠实验性高血脂症的降血脂作用。实验结果显示Lunasin能有效降低高血脂症大鼠血清中的谷丙转氨酶(ALT)，总胆固醇(TC)，低密度脂蛋白(LDL)，差异均达到显著水平(p＜0.05)，说明Lunasin能够降低血清中谷丙转氨酶(ALT)胆固醇(TC)以及低密度脂蛋白(LDL)的含量。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 生物活性肽

1．2 大豆生物活性肽

1．3 大豆生物活性肽Lunasin

1．3．1 Lunasin的发现

1．3．2 Lunasin的来源以及分布

1．3．3 Lunasin的结构与功能

1．3．5 Lunasin的研究进展

1．4 毕赤酵母高密度发酵工艺的研究进展

1．4．1 原核表达系统与真核表达系统

1．4．2 毕赤酵母表达系统

1．4．3 毕赤酵母高密度发酵工艺研究进展

1．5 膜分离技术的应用及其研究进展

1．5．1 膜分离的基本方法原理以及应用

1．5．2 膜分离技术在大豆多肽分离纯化中的应用

1．6 大鼠高脂血症模型

1．7 本课题研究的目的与意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 菌种

2．1．2 动物

2．1．3 试剂和试剂盒

2．1．3 培养基

2．1．4 本实验中所配制的溶液

2．1．5 饲料

2．1．6 主要仪器

2．2 方法

2．2．1 菌种保藏

2．2．2 菌种的活化

2．2．3 菌株生长特性

2．2．4 检测方法

2．2．5 摇瓶发酵优化

2．2．6 高密度发酵工艺优化

2．2．7 发酵液预处理

2．2．8 膜过滤工艺的优化

2．2．9 Lunasin降血脂作用的研究

3 结果与分析

3．1 菌种生长特性

3．1．1 一级种子液生长曲线

3．1．2 二级种子液生长曲线

3．2 BSA标准曲线

3．3 镍柱纯化结果

3．4 摇瓶发酵优化结果

3．4．1 温度对Lunasin表达量的影响

3．4．2 甲醇-山梨醇混合补料对Lunasin表达的影响

3．4．3 甲醇-甘露醇混合补料对Lunasin表达的影响

3．5 高密度发酵工艺的优化

3．5．1 不同甲醇流加策略对Lunasin表达的影响

3．5．2 不同诱导温度对Lunasin表达影响

3．5．3 甲醇-山梨醇共同补料对Lunasin表达量的影响

3．5．4 甲醇-甘露醇共同补料对Lunasin表达量的影响

3．5．5 甲醇-复合氦源共同补料策略对Lunasin表达量的影响

3．6 膜过滤工艺优化

3．6．1 不同压力下蛋白回收率以及通量变化

3．6．2 不同pH下蛋白回收率以及通量变化

3．6．3 不同温度下蛋白回收率以及通量变化

3．6．4 不同稀释倍数下蛋白回收率以及通量变化

3．6．5 不同稀释倍数下蛋白回收率以及脱盐率的变化

3．7 Lunasin降血脂活性的验证

3．7．1 大鼠体重变化

3．7．3 Lunasin对血液指标的影响

3．7．4 Lunasin对大鼠肝脏指数的影响

3．7．5 Lunasin各组大鼠肝脏病理学组织学检查

4 讨论

4．1 毕赤酵母产Lunasin高密度发酵工艺优化

4．2 膜分离技术工艺优化

4．3 Lunasin的生物活性验证

5 展望

参考文献

致谢