常规PCR结合CNVplex技术在检测鸡CNVs中的应用研究

摘要

长期进化导致鸡的基因组产生了大量的突变，这些突变对于研究鸡的基因功能和生物学机制提供了思路。鸡的一些性状，如鸡肉品质，蛋用质，羽色，鸡冠，喙色等一直是科研人员研究的重点。拷贝数变异(Copy number variations，CNVs)是指DNA长度在50bp以上的碱基序列的缺失、重复、插入或这些类型的组合形式。相对于单碱基突变的SNP，CNVs所含有的遗传信息更为丰富，也更有可能改变个体的基因表达水平进而影响个体的表型。
　　本研究以本实验室与湖北省欣华生态畜禽有限公司联合培育的隐性白羽矮脚欣华鸡专门化父本品系第三世代群体的443个个体为实验材料。首先，应用CNVplex技术对上述群体的17个候选CNVs位点进行拷贝数检测;其次，用常规PCR对CNVplex检测的结果进行验证和校正，以此评估CNVplex技术在鸡CNVs检测中的应用前景，并初步摸索出一套结合常规PCR和CNVplex检测鸡CNVs的方法;最后用校正后的拷贝数与鸡的蛋用性状进行关联分析，以期通过CNVs位点与蛋用性状之间的关联来深入了解分子育种的基础，并为后续的研究奠定基础。本论文具体研究结果如下:
　　(1)筛选了可信度较高的17个候选CNVs位点。应用CNVplex技术对所有443个样本的17个候选CNVs位点进行拷贝数检测，然后筛选出拷贝数变异较大的位点进行下一步研究。结果显示02A、05A、14A、14B这四个探针拷贝数变异显著。
　　(2)对上述4个探针序列的SNP进行检测，并评估SNP对CNVplex技术检测拷贝数的影响。结果显示02A探针序列存在3个SNP(G＞A、C＞T、T＞A)，05A探针序列存在2个SNP(A＞T、C＞T)，在本实验群体中，这些SNP位点在各自探针序列上是同时出现的;14A、14B探针序列无SNP。
　　(3)分别对包括02A、05A、14A、14B探针序列在内的片段进行常规PCR扩增，校正相应小数数值为整数数值。结果显示，探针序列存在SNP的02A、05A探针检测的拷贝数为0（包括接近0）的样本都能扩出相应的目的条带;而不存在SNP的14A、14B探针检测的拷贝数为0（包括接近0）的样本都不能扩出相应的目的条带。最后确定14A探针和14B探针检测结果是准确可靠的。
　　(4)以探针序列为核心区域，在14B探针上、下游每隔1kb左右设计一对引物，查找14BCNV区域的缺失边界。最终确定在chr13:286368-292611区域约6kb的DNA片段在欣华鸡中是缺失;且在14BCNV下游得到一个1.5kb的片段，该片段首次在欣华鸡中报道。
　　(5)对14BCNV和14ACNV与欣华鸡开产日龄等13个蛋用性状进行关联分析，结果显示:14ACNV位点2种拷贝数变异，即奇数拷贝数组(1、3、5)和偶数拷贝数组(0、2、4)与欣华鸡蛋壳厚度和蛋黄颜色是显著相关的(P＜0.05)。14BCNV位点6种拷贝数变异(0、1、2、3、4、5)与欣华鸡的开产日龄存在极显著相关(P＜0.01)，拷贝数为5的群体开产日龄127.1天要显著早于拷贝数为0的群体开产日龄131.9天。

目录

论文说明

声明

摘要

缩略词表(Abbreviations)

1 文献综述

1．1 CNVs简介

1．1．1 CNVs的形成和作用机制

1．1．2 CNVs的分类和基本类型

1．2 CNVs的研究进展

1．2．1 人类CNVs的研究进展

1．2．2 鸡CNVs的研究进展

1．3 CNVplex技术及其在CNVs中的应用

1．4 本研究CNVs位点相关基因

1．4．1 PCDHA11基因区域拷贝数变异位点

1．4．2 PCDHA基因簇

1．4．3 PCDHA基因簇的研究进展

1．5 研究目的和意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 实验鸡群与生产性状测定

2．1．2 主要实验仪器和设备

2．1．3 主要试剂

2．1．4 常用溶液及其配制

2．1．5 主要分子生物学软件和统计软件

2．2 方法

2．2．1 鸡血基因组DNA提取与检测

2．2．2 引物设计

2．2．3 PCR扩增及产物检测

2．2．4 回收克隆测序

2．2．5 CNVplex实验原理及实验操作步骤

3 结果

3．1 候选CNVs位点拷贝数统计

3．2 02A，05A，14A，14B探针序列SNP的检测

3．3 CNVplex技术实验误差的评估

3．3．1 无SNP实验误差评估

3．3．2 有SNP实验误差评估

3．4 CNVs与蛋用性状关联分析

3．4．1 14BCNV拷贝数的验证及边界查找

3．4．2 14BCNV、14ACNV位点拷贝数与蛋用性状的关联分析

4 讨论

4．1 CNVplex技术在拷贝数检测中的方法评估

4．2 14BCNV缺失断点边界的研究

4．3 CNVs与蛋用性状相关

5 结论与展望

5．1 本研究取得的成果

5．2 下一步研究计划安排

参考文献

致谢

附录