柑橘类苦味物质对LPS诱导小鼠巨噬细胞炎症反应的抑制作用及其机制研究

摘要

柑橘中的苦味物质是影响其口感的重要因素。炎症是具有血管系统生物机体对于损伤因子的防御反应，可以使受损机体修复和愈合，然而过度的炎症反应会导致自身免疫性疾病，还可能引发癌症、肥胖、糖尿病、脑血栓等多种疾病。研究柑橘类苦味物质苦味强度与其抗炎活性之间的关系对合理利用柑橘资源具有重要意义。本研究以LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7建立炎症模型，探究柚皮素、柚皮苷、柠檬苦素、橙皮素和新橙皮苷五种柑橘类苦味物质的抗炎活性及其机理，并且利用电子舌对五种柑橘类苦味物质的苦味强度进行测定，研究其苦味强度与抗炎活性之间的关系。主要研究结果如下：
　　1五种柑橘类苦味物质对细胞活力的影响
　　通过噻唑蓝比色实验（MTT）测定柚皮素、柚皮苷、柠檬苦素、橙皮素及新橙皮苷对RAW264.7细胞活力的影响，结果表明：五种苦味物质在浓度为200μM时对细胞活力有一定的影响，但细胞存活率在85％以上，浓度为400μM时，细胞存活率均降至50%以下。RAW264.7细胞经500 ng/L的LPS诱导24 h后，细胞变大，生长密集而紧凑，部分细胞长出伪足或者成为梭形，且胞内颗粒增多。
　　2五种柑橘类苦味物质对NO、TNF-α、IL-1β、IL-6分泌量的影响
　　LPS诱导后的细胞NO、TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌量显著增加，柚皮素、柚皮苷、柠檬苦素、橙皮素及新橙皮苷五种柑橘类苦味物质能够显著抑制NO、TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌，且浓度与抑制作用呈剂量依赖型。相同浓度下，柚皮素和橙皮素对细胞因子的抑制作用强于柚皮苷与新橙皮素，柠檬苦素的抑制作用最弱。
　　3五种柑橘类苦味物质对NF-κB信号通路上基因表达的影响
　　小鼠巨噬细胞RAW264.7经LPS诱导后NF-κB信号通路上的iNOS、p65、p50基因表达被激活，IκB基因的表达被抑制，柚皮素、柚皮苷、柠檬苦素、橙皮素和新橙皮苷五种柑橘类苦味物质能够显著抑制iNOS、p65、650基因的表达，抑制IκB磷酸化水解，从而抑制 NF-κB信号通路的激活。五种柑橘类苦味物质通过调控NF-κB信号通路上基因的表达发挥其抗炎作用，柚皮素和橙皮素的抗炎活性强于新橙皮苷和橙皮苷，在相同浓度下，柠檬苦素的抗炎效果相对较差。
　　4电子舌对五种柑橘类苦味物质苦味强度的评价
　　电子舌传感器可以将奎宁以及五种柑橘类苦味物质的不同浓度进行较好的区分，但是以奎宁作为苦味模型并不能准确的对柚皮素和橙皮素的苦度进行评价。在相同浓度下，柚皮苷、新橙皮苷、柠檬苦素三者之间的苦味强度依次为：柚皮苷<新橙皮苷<柠檬苦素。
　　柚皮素、柚皮苷、柠檬苦素、橙皮素及新橙皮苷五种柑橘类苦味物质能够显著抑制NO以及促炎性细胞因子的分泌，并且通过抑制NF-κB信号通路上相关基因的表达从而发挥抗炎的功效。实验所选的五种柑橘类苦味物质的抗炎活性与其的苦味强度之间没有显著相关性。

目录

声明

英文缩略语表

1 前言

1.1 柑橘类苦味物质的生理活性

1.2 炎症

1.3 LPS作用机制

1.4 NF-κB信号通路

1.5 苦味强度的评价方法

1.6 本课题的研究目的与意义

1.7 研究内容与创新点

2 材料与方法

2.1 材料与设备

2.2 实验方法

2.3 统计方法

3 结果与分析

3.1 MTT法测定苦味物质对细胞活力的影响

3.2 LPS诱导小鼠巨噬细胞炎症模型的建立

3.3 苦味物质对LPS诱导巨噬细胞NO生成量的影响

3.4 苦味物质对LPS诱导巨噬细胞炎症因子分泌量的影响

3.5 实时定量PCR检测NF-κB通路上相关信号因子的表达

3.6 免疫印迹法检测NF-κB通路上相关信号因子的蛋白表达量

3.7 柑橘类苦味物质苦度的评价

4 讨论

4.1 LPS诱导巨噬细胞炎症模型的建立

4.2 苦味物质抗炎机理

4.3 苦味物质苦味强度的测定分析

5 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

参考文献

致谢