睾酮调节巨噬细胞极化介导脂肪细胞分化与小鼠附睾脂肪积累

摘要

随着社会的进步与生活条件的改善，肥胖已经成为全球化健康问题。已有研究证明，睾酮作为体内重要的雄性激素广泛参与多种生物学过程，男性血清睾酮水平与脂代谢密切相关，血清睾酮偏低是导致男性肥胖的一大诱因。巨噬细胞是机体内重要的免疫细胞，它可在局部微环境的诱导下活化形成具有不同表型和功能的亚细胞型，这被称为巨噬细胞极化。经典的M1型极化以高表达促炎因子为特征，而M2型极化与过敏、免疫调节等作用相关，M2型极化分为3种亚型，本文主要以典型的M2a型极化为研究对象。已有研究证明，脂肪组织中的巨噬细胞极化表型的平衡与肥胖有着紧密的联系，但其中机制尚不明确。因此，本课题旨在探究睾酮与脂肪细胞分化和巨噬细胞极化之间的关联，为雄性激素与肥胖的研究提供理论基础。
　　本课题首先在体外以小鼠3T3-L1前脂肪细胞为研究对象，在诱导分化过程中给予不同浓度的睾酮(0-10-5 mol/L)处理或含有睾酮(10-7 mol/L)的诱导后M1/M2极化条件培养基处理，通过油红O染色、RT-qPCR检测脂肪细胞标志基因脂联素，瘦素，Cebpβ，Pparα，Il6, Tnfα表达水平以测定前脂细胞的分化程度。以小鼠RAW264.7巨噬细胞为研究对象，以LPS(1μg/mL)或IL-4(20 ng/mL)诱导其分别向M1与M2a方向极化，同时给予不同浓度的睾酮刺激，通过RT-qPCR检测M1型极化标志基因Nos2, Tnfα, Il6, Il1β与M2a型极化标志基因Arg1，Il10, Mgl2, Mrc1的mRNA相对表达水平，从而检测睾酮对巨噬细胞极化的作用。通过Western blot方法检测Akt蛋白S473位点磷酸化水平，从而探究睾酮在巨噬细胞内活化的信号通路。
　　本研究发现，睾酮并不直接影响3T3-L1前脂肪细胞分化，而是可通过诱导极化后的M1型巨噬细胞条件培养基显著抑制前脂细胞分化，而含有或不含有睾酮的M2a极化条件培养基对3T3-L1细胞分化的影响并不显著。RAW264.7细胞处理结果显示，睾酮并不直接引起RAW264.7巨噬细胞极化，但是睾酮可抑制LPS诱导的M1极化和促进IL-4诱导的M2a极化，并呈浓度依赖性。通过使用雄激素拮抗剂(HF)、雄激素受体抑制剂(ASC-J9)、Gαi蛋白抑制剂(PTX)、Akt1/2-siRNA进行细胞信号转导的研究，结果表明，睾酮对巨噬细胞极化的调节作用是通过Gαi蛋白和Akt蛋白的磷酸化产生的，而不是通过经典的雄激素受体通路。
　　在体内，本课题通过外源注射黄体生成素受体(LHR)多肽降低小鼠血清睾酮水平。结果显示，低血清睾酮小鼠附睾白色脂肪组织增大。石蜡切片结果显示，LHR多肽组脂肪细胞较对照组相比显著增大。免疫组化结果显示，肥胖的脂肪组织中有较多的M1型巨噬细胞，而其他对照组的脂肪组织中则是以M2a型巨噬细胞为主，且数量较少。而注射睾酮增补剂丙酸睾酮注射液(TPI)能逆转这一结果。
　　本研究首次在体外证明了睾酮对巨噬细胞极化有显著的调节作用。这种作用主要是通过Gαi蛋白与Akt蛋白通路产生，而不是经典的雄激素受体。睾酮对脂肪细胞分化的影响是通过调节巨噬细胞极化而间接产生的。本研究成功建立LHR多肽降低小鼠血清睾酮模型，从此模型中证明低血清睾酮可导致小鼠附睾白色脂肪组织增大，并伴有M1型巨噬细胞极化。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

1 睾酮概述

1．1 睾酮简介

1．2 睾酮与肥胖及相关疾病

1．3 睾酮的细胞内信号转导

2 巨噬细胞与极化概述

2．1 巨噬细胞极化简介

2．2 巨噬细胞极化的细胞内信号通路

2．3 脂肪组织巨噬细胞(ATMs)与脂肪代谢

3 本研究的目的与意义

1．1 主要仪器设备

1．2 主要试剂

1．3 主要溶液配制

1．4 试验动物

2 试验方法

2．1 RAW264．7巨噬细胞的培养与处理

2．2 3T3-L1细胞的培养与诱导分化程序

2．4 3T3-L1细胞油红O染色

2．5 细胞总RNA提取

2．6 总RNA的逆转录

2．7 RT-qPCR检测细胞因子相对表达水平

2．8 Western blot

2．9 LHR多肽注射剂的制备与试验动物的饲养与处理

2．10 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清LHR多肽抗体水平

2．11 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清睾酮水平

2．12 石蜡切片的制备

2．13 组织切片HE染色

2．14 组织切片免疫组织化学染色

3 数据统计与处理

结果与分析

1 检测睾酮对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响

2 检测睾酮能否引起RAW264．7巨噬细胞极化

3 检测睾酮对RAW264．7巨噬细胞M1与M2a型极化的作用

4 检测雄激素受体在睾酮对RAW264．7巨噬细胞极化调节中的作用

5 检测Gαi蛋白通路在睾酮对RAW264．7巨噬细胞极化调节中的作用

6 检测PTX处理后RAW264．7巨噬细胞Akt S473位点磷酸化水平

7 检测特异性抑制Akt1与Akt2对RAW264．7巨噬细胞极化的影响

8 检测含有睾酮的RAW264．7巨噬细胞极化条件培养基对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响

9 检测注射LHR多肽后，小鼠血清抗体与睾酮水平

10 小鼠附睾白色脂肪形态学观察与HE染色切片观察

11 免疫组化染色检测附睾白色脂肪组织中巨噬细胞类型

讨论

1 睾酮对巨噬细胞极化的调节作用

1．1 睾酮对巨噬细胞M1型极化的抑制作用

1．2 睾酮对巨噬细胞M2a型极化的促进作用

2 雄激素受体不是睾酮对巨噬细胞调节作用的关键靶点

3 Gαi与Akt蛋白是睾酮对巨噬细胞调节作用中的重要通路

3．2 Akt S473位点磷酸化水平分析

4 睾酮对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响

4．2 睾酮通过巨噬细胞极化培养基间接作用于3T3-L1细胞分化

5 低血清睾酮对小鼠附睾白色脂肪的影响分析

5．1 低血清睾酮造成小鼠附睾白色脂肪肥大

5．2 脂肪组织中巨噬细胞极化表型分析

结论

参考文献

发表文章

致谢