Chk1在猪卵母细胞减数分裂成熟过程中的作用及调控机制

摘要

猪是我国重要的肉用家畜，如何培育出产仔率高、生长快、易于管理、产肉率高和肉品质好的品种一直是养猪业所面临的问题，传统的杂交育种往往需要很长的育种周期，而通过转基因与克隆相结合的方法来培育猪新品种可缩短周期、提高效益，采用这种方法更容易得到符合人们需求的性状稳定的动物。但克隆技术需要大量成熟的卵母细胞，由于获取体内成熟卵母细胞比较困难并且成本高，所以目前克隆猪所需的卵母细胞主要通过抽取猪卵巢表面卵泡内的卵母细胞，再进行体外成熟培养来获取。与小鼠等其它哺乳动物的卵母细胞相比，猪卵母细胞体外成熟率低，所以如何提高猪卵母细胞体外成熟率及质量是亟待解决的问题。猪卵母细胞成熟是卵母细胞经历第一次减数分裂到达第二次减数分裂中期的过程，而生发泡期卵母细胞阻滞和第一次减数分裂后期起始抑制是阻碍卵母细胞成熟的两个主要原因。在很多细胞中，检验点激酶蛋白1(checkpoint kinase1，Chk1)在细胞周期的G2期以及有丝分裂期具有重要作用，哺乳动物卵母细胞生发泡期以及减数分裂期分别类似于体细胞G2期和有丝分裂期。因此，研究检验点激酶蛋白1在猪卵母细胞体外成熟过程中的作用及其分子机制具有重要意义。我们的主要研究结果如下:
　　①从猪卵巢中获得的卵丘卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes，COCs)分别通过体外培养至0h、24 h、28 h和44 h，将每个培养时间点取得的卵母细胞分别利用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative Real-time Polymerase ChainReaction，qRT-PCR)和免疫蛋白印迹(western blot，WB)的方法检测卵母细胞中Chk1的相对转录水平和相对蛋白表达水平，我们发现在猪卵母细胞体外成熟过程中，Chk1转录水平和蛋白表达水平在MI期出现高峰。对猪卵母细胞进行过表达外源Chk1-eGFP，我们发现Chk1主要定位于卵胞质中和纺锤体上。
　　②向猪卵母细胞胞质中显微注射Chk1 siRNA以敲低Chk1的表达，注射后的卵母细胞培养24 h或44 h后，我们发现Chk1敲低对卵母细胞生发泡破裂不产生任何影响，但会导致卵母细胞中期染色体异常，使卵母细胞停滞在第一次减数分裂中期。
　　③体外构建Chk1过表达载体，再进行体外转录获取Chk1 mRNA。向猪卵母细胞胞质内显微注射体外转录的Chk1 mRNA以过表达Chk1，注射后的卵母细胞培养至24 h或44 h后，我们发现过表达Chk1能够延迟卵母细胞生发泡破裂的发生，并导致卵母细胞成熟率的下降。
　　④敲低Chk1的猪卵母细胞培养28 h后取出，通过甲醛固定和荧光显微镜观察，我们发现在MI期之后Chk1敲低引起卵母细胞中Cyclin B1的降解受阻。
　　⑤敲低Chk1的猪卵母细胞培养28 h后，利用qRT-PCR对猪卵母细胞中的Mad2 L1、Mad2L2、Cdc20、Ndc80和Cdh1的转录水平进行检测，结果我们发现Chk1的敲低导致Mad2L1和Cdh1的转录水平下降。
　　以上研究结果表明，在猪卵母细胞中Chk1蛋白能够促进Cyclin B1在AI期及时降解，维持Mad2L1和Cdh1的转录水平，确保纺锤体组装检验点（spindle assemblycheckpoint，SAC）和APC-Cdh1发挥作用以及成熟促进因子(maturation promotingfactor，MPF)降解，从而使猪卵母细胞在MI期所有染色体正确排列在赤道面上，顺利通过MI期和进入AI期，并发育到第二次减数分裂中期。此外，我们还发现与小鼠卵母细胞成熟不同的是，猪卵母细胞不需要DNA损伤检验点的参与。

目录

声明

摘要

常用中英文缩略词表

1 前言

1．2 细胞周期各检查点及相互之间的影响

1．3 Chk1的结构、激活和降解失活

1．3．2 Chk1的激活与降解失活

1．4 Chk1的功能

1．5 Chk1与卵母细胞减数分裂成熟

1．5．2 Chk1对卵母细胞减数分裂成熟的调控

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 研究对象

2．1．2 主要实验仪器、耗材和试剂

2．1．3 主要的相关试剂配制

2．2 方法

2．2．1 猪卵母细胞培养

2．2．2 免疫荧光染色

2．2．3 荧光定量PCR

2．2．4 过表达载体构建与体外转录

2．2．5 显微注射

2．2．6 蛋白免疫印迹

2．2．7 数据统计分析

3 结果与分析

3．1 猪卵母细胞体外成熟培养过程中各个时期的确定

3．2 Chk1在猪卵母细胞成熟过程中的表达和亚细胞定位

3．3 Chk1敲低对卵母细胞第一次减数分裂的影响

3．4 Chk1过表达对卵母细胞减数分裂成熟的影响

3．5 Chk1的敲低对MI—AI期Cyclin B1降解的影响

3．6 Chk1的敲低对Mad2L1和钙粘蛋白1的影响

4 讨论

5 小结

6 主要创新点与特色

7 不足之处和下一步工作计划

参考文献

硕士期间发表文章

致谢