人表皮生长因子在干酪乳杆菌中的表达及其活性检测

摘要

肠道微生物群通过调控营养吸收、抑制病原菌定植及刺激黏膜免疫等方式对宿主健康产生重要影响。作为人及哺乳动物胃肠道的优势菌群，乳酸菌能抑制病原菌对肠道上皮的粘附、预防炎症，因此能有效预防肠道疾病。表皮生长因子(Epidermal growth factor，EGF)是一种调控细胞生长、增殖、分化的生长因子，应用于外伤治疗及辅助肠道感染修复中，效果显著。研究表明干酪乳杆菌(Lactobacillus casei，L.casei)能预防肠道疾病感染。实验室前期已构建多种干酪乳杆菌表达质粒，并成功表达异源蛋白。本研究拟构建表达人EGF(hEGF)的重组干酪乳杆菌，研究干酪乳杆菌作为黏膜免疫活菌疫苗传递载体，原位表达特定蛋白的可行性，并对其生物学活性进行了研究。主要结果如下:
　　SOE PCR合成Genbank报道的hEGF基因序列，克隆到三种表达载体上:胞内表达载体pELX1;以Spusp45为分泌信号构成的分泌表达载体pELSH;以SlpA蛋白作为信号进行表面展示的干酪乳杆菌表达载体pELWH。获得能够组成型表达hEGF蛋白的重组菌。经Western blot分析，只在重组菌L.casei/pEL WH-hEGF的胞内、细胞表面及培养液上清中检测到SlpA-hEGF融合蛋白，分子量约55 kDa。
　　体外培养小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3细胞，以L casei、L.casei/pEL WH为对照，添加L.casei/pELWH-hEGF培养液上清，观察SlpA-hEGF对底物细胞的增殖活性。结果表明SlpA-hEGF能促进细胞增殖，稀释10倍的L.casei/pELWH-hEGF上清的增殖效果与10 ng/mL的hEGF标品效果相同，此外在L.casei和L.casei/pELWH中也观察到了显著的促细胞增殖现象。
　　为检测重组菌对小鼠肠道形态结构的影响，选取体重18-22 g清洁级雌性小鼠，每天灌胃重组菌L.casei/pELWH-hEGF全培养液，设计空白对照(CK)、PBS、MRS、干酪乳杆菌全培养液(L..casei)、空载体全培养液(L.casei/pELWH)对照组。结果表明MRS组十二指肠的绒毛高度极显著高于PBS组(P＜0.01)，L.casei组与MRS组相比极显著提高了小鼠十二指肠绒毛高度(P＜0.01），pELWH-hEGF组与L.casei组、pELWH组相比极显著提高了小鼠十二指肠绒毛高度(P＜0.01），各处理组空肠高度、回肠高度及十二指肠、空肠、回肠隐窝深度差异在本试验中未达显著水平。
　　本研究为干酪乳杆菌成为一种优良的活菌蛋白传递载体提供理论依据及方法。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 前言

1．1 EGF及其生物学功能

1．1．1 EGF的发现

1．1．2 EGF的作用方式

1．1．3 EGF的生物学功能

1．1．4 EGF促进肠道损伤修复方式

1．2 重组乳酸菌作为黏膜免疫活菌疫苗载体的研究现状

1．2．1 乳酸菌概述

1．2．2 乳酸菌与黏膜免疫系统

1．2．3 乳酸菌作为黏膜免疫活菌疫苗载体的优势

1．2．4 乳酸菌表面锚定表达蛋白方式

1．2．5 重组乳酸菌作为黏膜免疫活菌疫苗载体的研究现状

1．2．6 干酪乳酸菌作为黏膜免疫活菌疫苗载体的研究现状

1．3 本研究的背景、目的意义及技术路线

2 材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌株和质粒

2．1．2 动物细胞

2．1．3 试验动物

2．1．4 引物

2．1．5 主要试剂

2．1．6 培养基及相关试剂配置

2．1．7 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 pELX-hEGF重组质粒的构建

2．2．2 重组质粒pELX-hEGF电转化干酪乳杆菌MCJΔ1

2．2．3 hEGF蛋白在干酪乳杆菌的表达鉴定

2．2．4 SlpA-hEGF的分泌活性鉴定

2．2．5 重组干酪乳杆菌全培养液对小鼠肠道形态的影响

3 结果与分析

3．1 pELX-hEGF重组质粒的构建

3．2 hEGF蛋白在L．casei MCJΔ1中的表达检测

3．3 SlpA-hEGF的细胞增殖活性鉴定

3．3．1 EGF标准品对小鼠胚胎成纤维细胞增殖的影响

3．3．2 SlpA-hEGF的细胞增殖活性

3．4 重组乳酸菌对小鼠肠道形态的影响

4 讨论

参考文献

攻读硕士期间的学术成果

致谢