猪肝脏组织中lincRNA的分子进化和甲基化模式研究

摘要

猪是重要的家养动物，是我国肉类蛋白的主要来源，其驯化始于大约一万年前，在驯化及品种分化过程中，为了适应复杂的生态环境、人类需求及选择方式形成了丰富多样的地方猪种，这些猪种的形态、生理和行为等特征存在较大的差异。近年来长链非编码RNA（lncRNA）调控作为一种独特的调控机制逐渐成为研究的热点，越来越多的研究表明lncRNA与哺乳动物性状密切相关，如lncRNA H19具有调节机体生长和肌肉发育的作用。随着高通量测序技术的发展，越来越多的lncRNA被鉴定，但是猪的lncRNA数据库还不完善，猪lncRNA的功能研究少之又少。本研究利用恩施黑猪(ES)、大白猪(LW)和贵州野猪(GZWB)肝脏组织的RNA-seq数据鉴定肝脏中的基因间长链非编码RNA(lincRNA)，对猪的lncRNA数据库进行进一步完善，并结合上述三个样本的肝脏甲基化组数据、已经发表的lincRNA数据及中国家野猪和欧洲家野猪的重测序数据，对lincRNA的分子特征、甲基化模式、表达模式、人工选择下的分子进化模式进行分析。此外，对重要的印记lncRNA H19进行详细的分子进化和甲基化模式分析，主要研究结果如下:
　　(1)通过对clean后的恩施黑猪、大白猪和贵州野猪的肝脏组织的RNA-seq数据进行Tophat比对、cufflink组装、cuffmerge去冗余及过滤，最终得到861条转录本，对应于713个lincRNA基因，其中有403个lincRNA与目前已经鉴定的lncRNA基因和注释的蛋白编码基因没有重叠，是我们新鉴定的lincRNA;结合已经鉴定的lincRNA及我们鉴定的lincRNA，对其上下游10kb区域的编码基因（潜在靶基因）的生物学功能进行预测，发现这些lincRNA的潜在靶基因主要参与转录调控、物质代谢和肌细胞分化。
　　(2)利用RNA-seq数据对lincRNA的表达模式进行分析，发现全基因组水平上，lincRNA的表达水平显著低于蛋白编码基因的表达水平， ES、LW和GZWB肝脏组织中全部lincRNA的表达水平没有显著的差异，对不同组织之间全部lincRNA的表达水平进行比较得出同样的结果。
　　(3)通过差异表达分析共发现72个lincRNA在三个品种猪的肝脏组织中差异表达，占总差异表达lincRNA的12.2％，其中有40个lincRNA是肝脏组织中特异表达的;对差异表达lincRNA的潜在靶基因的生物学功能进行预测，发现潜在靶基因可能在物质代谢、细胞增殖等生物学过程中起重要作用。
　　(4)利用三个猪种肝脏组织的BS-seq数据对lincRNA的甲基化模式进行分析，发现lincRNA不同功能区域的甲基化水平由高到低依次是内含子、外显子、转录终止位点(TTS)下游2kb、启动子，其中在启动子区和TTS下游2kb区lincRNA的甲基化水平要显著低于编码基因;转录起始位点(TSS)及TTS附近lincRNA及编码基因的甲基化都发生明显的降低，但是lincRNA降低的幅度要低于编码基因。
　　(5)通过比较三个猪种之间肝脏的甲基化组，鉴定了261个lincRNA在三个猪种之间差异甲基化;然后对两两比较得到的差异甲基化的lincRNA的潜在靶基因的生物学功能进行预测，发现这些差异甲基化的lincRNA的潜在靶基因主要参与转录、蛋白结合等生物学过程。
　　(6)整合分析lincRNA的启动子甲基化、lincRNA表达及其潜在靶基因的表达，发现lincRNA在TSS附近的甲基化水平与其表达水平存在负相关关系，且lincRNA的表达与其靶基因的表达存在正相关关系。
　　(7)通过利用欧亚家野猪的重测序数据筛选受选择lincRNA基因，发现10个lincRNA在驯化及品种分化过程中可能受到选择;结合差异甲基化和差异表达的lincRNA及肝脏特异表达的lincRNA，筛选到一个可能在驯化或品种分化过程中对肝脏代谢起重要作用的lincRNA—XLOC_032274。
　　(8)本研究对重要的印迹长链非编码RNA—H19进行详细的物种间进化分析，发现H19在物种间高度保守，且3'端较5'端不保守;分子进化分析发现H19在家猪中的核酸多样性要显著高于野猪的;分子微进化分析发现H19在猪的品种分化过程中遗传多样性增加，且通过构建邻接树(NJ)发现华中型和华南型聚成一支;对MeDIP数据分析发现H19基因及其上下游区域的甲基化水平存在品种间差异及组织间差异;对BS-seq数据及对应的RNA-seq数据分析发现H19的启动子区的甲基化可能会影响其表达，H19的ASM分析发现H19的印记可能与不同品种间的甲基化差异有关系。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 前言

1 研究问题的由来

2 文献综述

2．1 lncRNA的研究进展

2．2 H19的研究进展

3 研究的目的与意义

第二章 全基因组lincRNA的分子进化和表观遗传学研究

1 引言

2 材料与方法

2．1 技术路线

2．2 材料

2．3 方法

3 结果

3．1 肝脏组织RNA-seq数据分析

3．2 lincRNA的甲基化模式分析

3．3 lincRNA的启动子甲基化和表达的整合分析

3．4 lincRNA的表达和其潜在靶基因的表达整合分析

3．5 lincRNA的驯化模式分析

4 讨论

第三章 长链非编码基因H19的分子进化和甲基化研究

1 引言

2．2 材料

2．3 方法

3 结果

3．1 大尺度物种间H19的进化分析

3．2 筛选H19的受选择信号

3．3 H19的核酸多样性分析

3．4 H19的甲基化分析

4 讨论

1 本研究的主要结论

2 本研究的创新点与特色

3 本研究的不足之处与进一步的工作建议

参考文献

附录

攻读学位期间撰写论文题录

致谢