日本乙型脑炎病毒进入中枢神经系统途径的研究

摘要

日本乙型脑炎(Japanese encephalitis，JE)简称乙脑，是由日本乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis virus，JEV)引起的一种人畜共患的传染病。乙脑病毒是一种典型的嗜神经病毒，主要经蚊媒传播。乙脑病毒穿越血脑屏障(Blood Brain Barrier,BBB)进入中枢神经系统(CNS)是日本乙型脑炎发生的关键环节，同时也是引发宿主临床症状的决定性因素。虽然对黄病毒家族其它成员的神经入侵途径已有报道，但是乙脑病毒通过何种途径进入中枢神经系统还不清楚。由于乙脑病毒对人类健康所产生的巨大危害，但是目前还没有针对乙型脑炎的特异性药物。因此，探究乙脑致病机制，尤其是乙脑病毒神经入侵的途径，对该病的临床防治具有重要作用。
　　本研究主要是探讨乙脑病毒入侵中枢神经的途径。首先，以乙脑病毒感染C57BL/6小鼠，并且于感染后的每天分离小鼠的脑、嗅球和脊髓。RT-PCR和免疫荧光荧光检测这些组织中的病毒。结果显示，脑中检测到病毒的时间点早于嗅球和脊髓。用乙脑病毒处理CD3+T细胞、CD19+B细胞和Ly6c+单核细胞，而后再把这些细胞回输到健康小鼠脑组织内。RT-PCR和免疫荧光检测回输组小鼠脑中的病毒载量。结果表明回输组小鼠脑组织中都能检测到乙脑病毒。流式细胞术检测免疫细胞表面趋化因子受体的表达，发现单核细胞和T细胞上部分趋化因子受体的表达上调。此外，内皮细胞对T细胞和单核细胞的粘附试验证实了脑血管内皮细胞对单核细胞的粘附增加，同时内皮细胞和单核细胞表面与迁移相关的粘附分子及其配体的表达增加。
　　以上结果显示:乙脑病毒主要通过血源性途径入侵中枢神经系统;乙脑病毒可以感染CD3+T细胞、CD19+B细胞、Ly6c+单核细胞等多种免疫细胞;乙脑病毒感染促进了脑血管内皮细胞对单核细胞的粘附，使单核细胞更容易穿越血脑屏障进入中枢神经系统。综上所述，乙脑病毒可以由单核细胞携带进入中枢神经系统。

目录

声明

摘要

缩略语表(Abbreviation)

1 文献综述

1．1 日本乙型脑炎简介

1．2 日本乙型脑炎的发现

1．3 日本乙型脑炎的流行病学

1．3．1 流行与分布

1．3．2 乙脑的传播

1．4 乙型脑炎的病原

1．4．1 乙脑病毒的分子结构

1．4．2 乙脑病毒的理化性质

1．4．3 乙脑病毒的复制

1．4．4 乙脑病毒的致病过程

1．5 乙型脑炎的诊断和防控

1．6 血脑屏障

1．6．1 血脑屏障概述

1．6．2 病原微生物穿越BBB的途径

1．7 白细胞穿越血管内皮层的机制

1．8 粘附分子

1．9 趋化因子及其受体

2 研究目的及意义

3 实验材料和方法

3．1 实验材料

3．1．1 病毒、细胞和质粒

3．1．2 药品和试剂

3．1．3 培养基及其配制

3．1．4 溶液及其配制

3．1．5 实验动物和实验所用手术器械

3．1．6 重要仪器及设备

3．2 实验方法

3．2．1 细胞的复苏和培养

3．2．2 JEV-P3株的扩增与滴定

3．2．3 动物饲养及攻毒

3．2．4 脑组织和脊髓的取材、固定

3．2．5 细胞培养

3．2．6 JEV感染bEnd．3 细胞

3．2．7 免疫组化

3．2．8 组织和细胞RNA的提取

3．2．9 反转录PCR

3．2．10 荧光定量PCR

3．2．11 Western Blot

3．2．12 小鼠脾脏单细胞悬液的制备

3．2．13 细胞表面染色

3．2．14 流式细胞术数据分析

3．2．15 数据统计分析

3．2．16 手术器械消毒

3．2．17 实验动物及废物无害化处理

4 结果与分析

4．1 JEV-P3株病毒毒价的测定

4．2 JEV入侵中枢神经系统的途径

4．3 JEV对免疫细胞的感染

4．4 免疫细胞上趋化因子受体的表达

4．5 免疫细胞与内皮细胞间的粘附

4．6 JEV感染对粘附分子表达的影响

5 讨论

5．1 JEV的神经入侵途径

5．3 JEV感染对趋化因子受体表达的影响

5．4 bEnd．3 对T细胞和和单核细胞的粘附

5．5 JEV感染诱导粘附分子表达上调

6 结论

参考文献

致谢