二球悬铃木AG基因第二内含子的克隆与功能研究

摘要

二球悬铃木(Platanus acerifolia Willd)是一种被人们广泛栽培的行道树种，它有很多优点，如栽培容易、生长迅速、树形挺俊、冠大荫浓、抗病虫害等。但是，二球悬铃木在每年春末夏初之时，大量花粉随风飞洒，同时隔年的种球散开脱落，造成“飘粉飞毛”现象，严重影响人们的工作生活，很大程度上限制了推广应用。
　　本研究通过分析悬铃木AGAMOUS(AG)基因第二内含子的表达特性，进而驱动细胞毒素基因培育不育转基因植株的策略，来解决悬铃木花粉和种毛污染问题。我们先通过TAIL-PCR的方法分离得到二球悬铃木AG基因第二内含子，然后用内含子驱动GUS基因和毒性基因构建融合表达载体，转化烟草与拟南芥对内含子的表达特性和功能进行分析鉴定，主要研究成果如下:
　　1.AG基因第二内含子具有调控AG基因特异表达的特性，因此克隆了二球悬铃木
　　AG同源基因PlacAG基因4644bp第二内含子的序列，命名为PlacAGI，利用生物信息学的方法对PlacAGI序列的调控元件做了初步的预测分析，分析结果证明PlacAGI包含了大量的组织特异调控元件。
　　2.构建了fPlacAGI∷GUS，rPlacAGI∷GUS，fPlacAGI-mi35S∷GUS，rPlacAGI-mi35S∷GUS融合表达载体并转化了烟草与拟南芥，通过对转基因植株的组织进行GUS染色检测，结果发现在转GUS表达基因的烟草和拟南芥的雌蕊和雄蕊中GUS特异表达，在其它部位GUS基因未表达。这表明PlacAGI具有严格的组织特异性，能够调控连接在其下游的基因在花的第三、四轮器官特异表达。
　　3.构建了不育植物表达载体fPlacAGI∷Barnase-mi35S-Barstar，rPlacAGI∷Barnase-mi35S-Barstar,fPlacAGImi35S∷Barnase-mi35S-Barstar,rPlacAGImi35S∷Barnase-mi35S-Barstar并转化烟草，得到四种载体的转基因阳性植株，通过对阳性植株的表型观察与分析，结果表明，AG基因第二内含子能够特异的调控连接在其下游的Barnase基因特异的表达于转基因烟草的雄蕊和心皮，导致这两轮花器官消融。同时，转化烟草出现强表型和弱表型之分，强表型植株花的第二、三、四轮花器官均消融，花直接早落;弱表型植株仅第三、四轮花器官消亡。同时还发现悬铃木AG基因第二内含子正向与反向插入载体对其功能的行使有影响，正向插入时转基因烟草的表型更为明显。还发现PlacAGI具有微弱的启动子功能，在其下游没有连接60bp35S核心启动子片段的情况下也能特异的启动紧连在其下游的表达基因特异表达。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 引言

1．1 二球悬铃木简介

1．2 文献综述

1．2．1 二球悬铃木研究现状

1．2．2 植物花发育模型研究

1．2．3 植物MADS-box基因研究

1．2．4 植物基因内含子功能的研究

1．2．5 AG基因及其第二内含子研究

1．3 本研究的目的与意义

2 材料与方法

2．1 实验材料与试剂

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验试剂

2．2 实验方法

2．2．1 二球悬铃木基因组DNA的提取

2．2．2 PlacAG第二内含子(PlacAGI)的克隆与序列分析

2．2．3 载体构建

2．2．4 根癌农杆菌介导的遗传转化

2．2．5 GUS表达载体转基因烟草的阳性检测和组织化学染色

3 结果与分析

3．1 PlacAG内含子的克隆与序列分析

3．2 载体的构建结果

3．2．1 pPlacAGI：：GUS表达载体的构建

3．2．2 PlacAGI：：Barnase-mi35S-Barstar不育载体的构建

3．2．3 mi35S：：GUS和 PlacAGI-mi35S-GUS表达载体的构建

3．2．4 PlacAGI-mi35S：：Barnase-mi35S-Barstar表达载体的构建

3．2．5 hPlacAGI-mi35S：：Barnase-mi35s-Barstar表达载体的构建

3．3 GUS载体转基因植株的组织化学染色

3．3．1 GUS载体转基因烟草的组织化学染色

3．3．2 GUS载体转基因拟南芥的组织化学染色

3．4 不育载体的转基因验证分析

4 讨论

参考文献

附录

致谢