补充硼对非洲鸵鸟鸡脾、肾、肝发育的影响

摘要

本文分为以下几个部分进行探讨：
　　1.硼对脾的影响
　　在研究中检测了硼对脾发育变化之间的关系和硼（以硼酸的形式）对Hsp40/70表达水平的影响。将30羽健康雏鸵鸟随机分为6组:Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅵ组，分别饲喂添加0，40，80，160，320，640mg/L硼的基础日粮。通过HE染色对脾组织进行病理学检查;采用IHC和Western blot检测技术分析Hsp40/70的表达水平;并通过实时荧光定量PCR(qPCR)检测Hsp40/70的mRNA表达水平。为了研究细胞凋亡，分析了所有处理组的TUNEL反应。该部分研究工作的内容和结果如下:
　　1.1硼对鸵鸟脾组织结构的影响
　　与Ⅰ组的结果相比，Ⅱ组没有显著性差异。与Ⅰ组比较，Ⅲ组和Ⅳ组白髓的数量和体积增多，边缘区细胞密集增厚，边界清晰。试验组Ⅴ和Ⅵ组织病理学变化明显;白髓的数量和体积减少，边界不清晰。
　　1.2硼对Hsp40/70在雏鸵鸟脾中分布的影响
　　Hsp70主要在脾脏组织中呈弥漫分布。与Ⅰ组的结果相比，Ⅱ组的Hsp70的分布无显著性差异，但Ⅲ组，特别是饲喂添加160mg/L硼的Ⅳ组的Hsp70分布差异显著。然而，高硼处理组的Hsp70阳性信号的分布开始下降，其在Ⅵ下降得犹为明显。此外，与Ⅰ组相比，Ⅱ组中阳性信号IOD略有增加，但无显著性差异;Ⅲ组和Ⅳ组中Hsp70阳性信号的IOD显著性升高。然而，Ⅴ组阳性信号的IOD却略有降低，但无显著性差异，Ⅵ组阳性信号的IOD显著性降低。通过蛋白免疫印迹分析，Hsp70表达量水平与免疫组化结果的趋势相似。随着硼含量的增加，Hsp70s表达量也增加并在Ⅳ组中达到峰值。Hsp40的表达量的趋势与Hsp70的相似;然而，与Hsp70相比，相同组中Hsp40的表达量较少。这表明Hsp40是Hsp70的辅因子，有助于Hsp70的活性。
　　1.3硼对鸵鸟脾Hsp40/70mRNA表达量的影响
　　Ⅱ组（40mg/L硼）中Hsp40/70的mRNA表达量水平高于Ⅰ组;Ⅲ组mRNA表达量水平显著升高;Ⅳ组mRNA表达量水平达到峰值，之后Hsp40/70的mRNA表达量水平开始下降;Ⅵ组的mRNA表达量水平最低，与Ⅰ组（对照组）相近。mRNA表达量下降，表明Hsp40/70mRNA表达量是呈现剂量依赖性的，最初在较低剂量下诱导表达，然后在较高量的硼处理组中被抑制。
　　1.4硼对鸵鸟脾细胞凋亡的影响
　　为了检测硼对雏鸵鸟脾细胞凋亡的影响，采用TUNEL法评估细胞凋亡。TUNEL细胞主要是棕色颗粒的细胞。在Ⅱ组，Ⅲ组和Ⅳ组中，TUNEL阳性信号弱于Ⅰ组;但在第Ⅴ组，特别是Ⅵ组（640mg/L硼）TUNEL阳性信号增强。IOD分析显示Ⅱ-Ⅳ组水平较低，Ⅳ组最低;而与Ⅰ组相比，Ⅴ组和Ⅵ组的IOD水平显著升高。
　　2.硼在肾脏组织发育中的作用
　　在本试验中，研究了硼对雏鸵鸟肾的作用，特别是抗氧化能力。将48羽雏鸵鸟随机分为6组，在饮用水中补充不同浓度的硼。测定相对氧化/抗氧化酶(T-AOC，MDA，GSH-Px，CAT，GR,SOD)和肾细胞凋亡各项指标。通过qPCR测量该通路(Nrf2，HO-1和GCLC)中3个重要基因的表达，并通过免疫组化分析关键调节因子Nrf2的定位。研究的相应内容和结果如下:
　　2.1硼对雏鸵鸟肾组织凋亡的影响
　　凋亡的细胞分布在肾的各个部位，这些细胞基本上是棕色颗粒的细胞。与对照组相比，Ⅱ组和Ⅲ组凋亡细胞数量较少。饲喂添加160mg/L硼基础日粮处理组凋亡细胞数量略有增加，当添加剂量达到320mg/L时凋亡细胞数明显增加，在640mg/L剂量时达到峰值。此外，IOD分析显示Ⅱ组和Ⅲ组的水平较低，Ⅲ组水平最低，而与对照组相比，Ⅴ组和Ⅵ组IOD水平显著升高。
　　2.2硼对雏鸵鸟肾组织抗氧化活性的影响
　　与对照组相比，添加40mg/L和80mg/L硼组MDA含量分别显著降低了26.02％和48.12％，然而添加160-320mg/L硼时增加，640mg/L硼组增加了一倍。添加40mg/L硼组雏鸵鸟肾组织T-AOC活性与对照组相比没有差异，添加80mg/L硼组则明显升高。相反，添加640mg/L硼组T-AOC活性显著下降，与同组MDA含量变化相反。雏鸵鸟肾组织的GSH-PX活性在添加40和80mg/L硼组略有增加，但差异不显著。然而，GSH-PX在添加160，320mg/L硼组显著增加了约50％，添加640mg/L硼组增加了一倍。
　　2.3硼对雏鸵鸟肾组织Nrf2抗氧化通路的影响
　　研究结果表明，在低剂量硼组，Nrf2阳性产物主要分布在肾近端小管，而高剂量组Nrf2阳性产物分布主要位于上皮细胞中。IOD分析显示，低剂量组Nrf2阳性产物的分布较高，而与Ⅰ组相比，高剂量组的Nrf2阳性产物分布较少。抗氧化通路(Nrf2，HO-1，GCLc)中3个重要基因的qPCR分析显示不同组之间相似而强烈的差异。与对照组相比，当添加硼达到160mg/L剂量时能显著提高了雏鸵鸟肾组织中Nrf2的表达水平，添加80mg/L硼组达到峰值。除了添加40mg/L硼组外，其他添加硼组抗氧化通路GCLc表达量水平均显著升高，添加80mg/L硼组达到最大值。此外，与其他抗氧化因子相比，硼对雏鸵鸟肾组织中HO-1表达量水平的影响是最大的。
　　3.硼对肝脏功能的影响
　　在非洲鸵鸟饮用水中添加硼酸(0mg，40mg，80mg，160mg，320mg和640mg)，观察并检测雏鸵鸟肝中由不同剂量硼引起的组织学，细胞凋亡，组织化学和血清生化参数的变化。通过HE染色和PAS染色评估不同组的组织结构变化;通过TUNEL检测细胞凋亡情况;通过分光光度法检测血清生化指标。得到的结果如下:
　　3.1硼对肝组织结构的影响
　　90羽鸵鸟肝显示出良好的结构，具有丰富的细胞数量和不同形状的肝门管区。在低剂量硼组，进一步发现肝细胞发育良好，肝门管区清晰可见。在高剂量组中观察到肝组织结构发生改变。与硼中毒有关的主要病变包括:肝门管区炎症和肝细胞病变。肝门管区炎症在Ⅵ组最严重。在肝组织的一些肝细胞中观察到轻度症状，添加640mg/L硼剂量组中较多。此外，一些肝细胞还观察到核疱化。同时，还观察到的部分的核固缩和坏死。
　　3.2硼对糖原含量的影响
　　Ⅱ组糖原含量高于Ⅰ组，Ⅲ组糖原含量最高，有显著性差异。Ⅳ组可能是最佳剂量，之后糖原量开始下降。与Ⅰ组比较，在Ⅴ组和Ⅵ组中糖原含量最少。经IOD分析证实了以上所述各组糖原水平。
　　3.3硼对雏鸵鸟肝细胞凋亡的影响
　　低剂量组显示较少的细胞凋亡，Ⅱ组中细胞死亡最少。与Ⅰ组相比，高剂量组，特别是添加640mg/L硼组中肝细胞凋亡量较多。IOD的统计学分析与本研究的TUNEL结果相似，表明硼对细胞凋亡具有剂量依赖性作用，并且添加超过160mg的硼剂量会使更多的细胞凋亡。
　　3.4硼对血清生化指标的影响
　　血清生化指标受硼剂量的影响显著。高剂量组（添加320mg/L，特别是640mg/L硼组）酶活性参数与空白组相比差异显著。同时，参与代谢的血清生化指标在低剂量组（至Ⅳ组）中显示出硼有利的作用。总体结果表明硼在低剂量（80-160mg/L硼酸）对肝酶活性和代谢有正面的影响，高剂量（主要是640mg硼酸/L）则具有相反的作用。
　　简言之，总体结果表明适当的膳食硼摄入量（约160mg）可以使雏鸵鸟各组织发育良好，提高抗氧化的能力，减少细胞的凋亡和正向调节各项血清生化指标。然后，高剂量的硼能引起中毒反应并表现出明显的组织学结构病变。此外，长期超量添加硼会导致HSP表达量下降，糖原消耗过多，细胞凋亡增多和酶活性增加，这些都与硼的作用密切相关。