SVCV G蛋白与宿主蛋白14-3-3β/α-A相互作用的研究

摘要

鲤春病毒血症病毒(Spring Viraemia of Carp Virus，SVCV)属于弹状病毒科鲤春病毒属，是一种严重危害鲤养殖安全的传染性病原，感染鱼后能引起典型的鲤春病毒血症(Spring Viraemia of Carp，SVC)。该病在欧洲、亚洲和北美洲的鲤养殖区是较为常见的流行性疾病，虽然该疾病在我国还未检测到大规模暴发，但作为鲤养殖大国，该病对我国的鲤养殖产业构成潜在的巨大威胁。SVCV感染能引起鱼体体表出血、腹水和泄殖孔发炎等症状，严重者导至死亡。目前，SVCV的致病机理和入侵机制尚不清楚。SVCV结构蛋白糖蛋白(Glycoprotein，G)位于病毒囊膜上，在病毒入侵细胞时的内吞过程中发挥作用，该蛋白可以决定病毒的血清型。研究表明，SVCV蛋白与宿主蛋白的相互作用对病毒的免疫逃逸和复制产生重要影响。因此，研究SVCVG蛋白与宿主蛋白的相互作用对揭示该病毒的入侵与致病机理、抗病毒药物和预防疫苗的开发具有重要的科学意义。
　　首先，利用串联亲和纯化(Tandem Affinity Purification，TAP)与质谱分析相结合的方法，在FHM细胞中筛选出可能与SVCV G蛋白相互作用的宿主蛋白。其次，用激光共聚焦和免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation，Co-IP)共同验证，实验结果表明了SVCV G可以与宿主14-3-3β/α-A蛋白发生相互作用。通过对14-3-3β/α-A蛋白序列进行比对和同源性分析，发现14-3-3β/α-A在哺乳动物、鸟类、两栖类和鱼类中高度保守，其同源性高达97％。FHM细胞在感染SVCV后，14-3-3β/α-A的蛋白和mRNA水平都显著下降。在FHM细胞中过表达14-3-3β/α-A会促进SVCV的黏附和入侵，然而，14-3-3β/α-A对SVCV在感染后期的复制没有影响。本文首次证明了宿主蛋白14-3-3β/α-A与SVCV G蛋白发生相互作用，并且能促进SVCV的入侵和黏附，为揭示SVCV的致病机理和抗病毒药物的研发提供了新的理论依据。

目录

声明

摘要

缩略语表(Abbreviation)

1 文献综述

1．1 鲤春病毒血症病毒的简介

1．3 SVCV的分子结构特征

1．3．2 SVCV致病机制

1．4 弹状病毒糖蛋白与宿主蛋白相互作用的研究

1．5 蛋白间相互作用的研究方法

1．5．1 检测未知相互作用蛋白方法

1．5．2 检测已知相互作用蛋白方法

1．6 14-3-3蛋白家族研究进展

1．7 14-3-3蛋白家族的功能

1．7．1 细胞周期和凋亡中的14-3-3蛋白

1．7．2 蛋白转运中的14-3-3蛋白

2 研究目的和意义

3 实验材料与方法

3．1 实验材料

3．1．1 质粒、菌株

3．1．2 细胞、毒株

3．1．3 主要药品及试剂

3．1．4 主要培养基及其配制

3．1．5 主要缓冲液及其配制

3．1．6 主要实验仪器和设备

3．1．7 主要使用的生物学分析软件

3．2 实验方法

3．2．1 FHM细胞的培养与转染

3．2．2 SVCV在FHM细胞的增殖和感染

3．2．3 细胞样品的收集方法

3．2．4 蛋白兔疫共沉淀实验(Co-IP assay)

3．2．5 蛋白银染实验

3．2．6 基因克隆与质粒构建

3．2．7 荧光定量PCR实验

3．2．8 蛋白免疫印迹实验(Western blotting)

3．2．9 免疫荧光实验

3．2．10 空斑实验(Plaque assay)

3．2．11 串联亲和纯化(TAP)

4 实验结果

4．1 利用串联亲和纯化法(TAP)筛选与SVCV G蛋白相互作用的宿主蛋白

4．2 疑似SVCV G蛋白相互作用的宿主蛋白的质谱结果与分析

4．3 SVCV G蛋白相互作用的宿主蛋白的序列分析

4．4 宿主蛋白14-3-3β／α-A的基因克隆与真核表达

4．5 SVCV G蛋白与宿主蛋白相互作用的验证

4．6 SVCV感染FHM细胞对14-3-3β／α-A有降解作用

4．7 过表达14-3-3β／α-A会促进SVCV对FHM细胞的黏附和入侵

5 讨论

参考文献

附录

致谢