基于蛋白组学技术的马铃薯晚疫病菌PAMP诱导免疫反应机制解析

摘要

马铃薯是我国第四大粮食作物，对维护我国粮食安全起重要作用，然而由Phytophthora infestans所引起的晚疫病严重威胁着马铃薯的生产。病原相关分子模式(PAMP)在进化上非常保守，由PAMP诱导免疫反应(PTI)可以为马铃薯提供更为持久的晚疫病抗性。INF1是研究地比较清楚的晚疫病菌分泌的一种PAMP。CF是晚疫病菌液体培养滤液，其中除了主要含有INF1外，还含有其它类型PAMP。本研究分别用iTRAQ和SWATH蛋白质组学技术对INF1和CF诱导后的本氏烟草进行蛋白定量分析，并结合生物信息学手段对采集到的蛋白数据进行分析，探索马铃薯晚疫病PAMP诱导免疫反应机制。主要结果如下:
　　1.通过iTRAQ技术对INF1诱导8h后本氏烟草叶片进行蛋白分析，总共鉴定到2964个蛋白，其中32个受INF1诱导差异表达，包括15个上调表达蛋白和17个下调表达蛋白。
　　2.进一步对8个上调表达的差异蛋白基因进行了功能验证，通过对目标蛋白基因进行病毒诱导沉默(VIGS)后注射瞬时表达INF1基因，发现ATP依赖的转运蛋白(K4CBY0)和60S核糖体蛋白(O24114)对INF1诱导的免疫反应非常必要。
　　3.通过SWATH技术对CF分别诱导0h、8h、12h、24h、48h后的本氏烟草叶片进行蛋白分析，总共鉴定到4401个蛋白。与0h鉴定到的蛋白表达量相比，有1771个在8h、12h、24h、48h4个时间点中至少一个时间点受CF诱导差异表达。结果总共鉴定到984个上调表达蛋白和799个下调表达蛋白，而其中有12个蛋白非单纯上调或下调。
　　4.对筛选到的1771个差异蛋白进行GO注释，发现这些差异蛋白主要定位在质体，其次是在蛋白复合体、胞质溶胶、细胞质和线粒体等细胞组份，其主要通过离子结合和氧化还原等活性，参与胞内生物合成代谢、小分子合成代谢、胞内氮化合物代谢和胁迫响应等生物学过程，还有部分蛋白参与细胞免疫和细胞凋亡等抗病相关的生物学过程。
　　5.通过KEGG分析发现部分差异蛋白参与植-病互作、Ca+信号转导和MAPK信号、氧化磷酸化、蛋白运输、苯丙氨酸代谢等途径。其中鉴定到一些已知参与PTI抗性的重要蛋白如BSK1、SGT1、HSP90和NtCDPK2等，相关信号通路中新发现的蛋白很可能也在植物PTI抗性中扮演重要角色。

目录

声明

摘要

缩略词

1 前言

1．1 马铃薯与晚疫病

1．2 植物的双层免疫系统

1．3 胞内免疫(R基因抗性)的局限性

1．4 胞外免疫的重要性及优势

1．5 Elicitin诱导的信号途径

1．6 蛋白组学技术

1．7 本研究的目的与意义

2 基于iTRAQ技术分析本氏烟草中INF1诱导的差异蛋白

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．2．1 植物材料

2．2．2 菌株及载体

2．2．3 主要试剂及仪器

2．2．4 样品处理和iTRAQ蛋白组检测

2．4．5 关键基因的VIGS载体的构建

2．4．6 植物总RNA抽提及反转录cDNA的合成

2．4．7 定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)

2．3 结果与分析

2．3．2 INF1诱导后差异表达蛋白鉴定与功能分析

2．3．3 利用VIGS技术对上调表达蛋白进行功能分析

2．4 讨论

2．4．1 参与信号转导／转录的蛋白

2．4．2 参与转运相关的蛋白

2．4．3 参与光合作用的蛋白

2．4．4 防御相关的蛋白

2．4．5 参与蛋白质合成相关的蛋白

3 基于SWATH技术分析晚疫病菌PAMP诱导本氏烟中的差异蛋白

3．1 前言

3．2．1 材料与仪器

3．2．2 CF制备及烟草叶片注射

3．2．3 本氏烟叶片蛋白质的提取

3．2．4 总蛋白的酶切

3．2．5 酶解蛋白液的除盐干燥

3．2．6 第一维高pH反向(Reversed-phase)高效液相分离

3．2．7 参考质谱数据库的建立

3．2．8 SWATH数据采集

3．2．9 SWATH数据定性与定量分析

3．3 结果分析

3．3．1 CF诱导后本氏烟草叶片表型变化

3．3．2 SWATH中CF诱导本氏烟草中蛋白的鉴定

3．3．3 质谱数据主成分分析

3．3．4 CF诱导本氏烟中的差异表达蛋白分析

3．3．5 差异蛋白聚类分析

3．3．6 差异蛋白GO注释分析

3．3．7 差异表达蛋白KEGG通路及表达模式分析

3．4 讨论

参考文献

附表

致谢