抗广谱性除草剂转基因油菜创制及抗性评价

摘要

油菜是我国最主要的油料作物之一。油菜生育期内田间草害严重，且单子叶和双子叶杂草混生，对除草剂的种类、用药剂量和用药时间均有严格要求，选择性除草剂往往难以达到理想的除草效果。因此，培育抗广谱性除草剂品种对提高油菜生产效益有重要价值。目前我国还没有具有自主知识产权的广谱非选择性抗除草剂油菜品种。
　　本研究旨在利用农杆菌介导的油菜下胚轴遗传转化方法，将新型抗草甘膦基因I.variabilis-EPSPS*和抗草铵膦基因RePAT*分别转入甘蓝型油菜品系甲9707中，创制具有实用价值和自主知识产权的抗草甘膦和草铵膦转基因油菜。主要研究结果如下:
　　(1)在转I.variabilis-EPSPS*基因油菜植株获得过程中在30mg/L草甘膦选择压条件下，共得到了130株再生植株，其中126株为阳性植株，以目标基因为靶点的PCR检测证明，再生植株的阳性率为97％。
　　(2)对转I.variabilis-EPSPS*基因油菜T0代抗性处理结果表明，在用41％草甘膦异丙胺盐（农达）商品制剂稀释100倍后喷洒条件下仍能保持正常生长，对照完全死亡。
　　(3)通过Southern blot检测，从96份转I.variabilis-EPSPS*油菜T0代植株中鉴定到43份单拷贝插入转基因材料。
　　(4)采用Tail-PCR和Inverse-PCR方法，对T0代43份单拷贝转I.variabilis-EPSPS*基因材料进行T-DNA侧翼序列分析，共分离了31份材料的插入位点侧翼序列。这31份材料中共有14种具有不同插入位点的转化事件。
　　(5)对7个T1代转I.variabilis-EPSPS*基因油菜家系的抗性鉴定表明，这些材料在稀释100倍的41％草甘膦异丙胺盐（农达）制剂喷洒条件下仍能正常生长，而对照在稀释200倍处理下全部死亡。单拷贝转基因家系处理后存活株与死亡株比例符合3∶1的单基因分离比。
　　(6)采用RT-PCR和Western blot方法，分别对部分T1代转I.variabilis-EPSPS*基因油菜家系的叶片组织进行了基因表达和蛋白水平分析。所测转基因植株中目的基因I.variabilis-EPSPS均有表达，但表达量在不同材料间有所差异。转基因后代材料均可检测到蛋白的表达，但不同材料之间蛋白表达水平存在明显差异，蛋白质水平和基因表达水平是一致的。
　　(7)比较了来自三个不同转化事件的转I.variabilis-EPSPS*材料和含有CP4-epsps基因材料的抗草甘膦表现。结果表明，含有不同抗性基因的两类材料具有相似的草甘膦耐受水平。
　　(8)采用下胚轴为外植体的油菜转化技术，在2.5mg/L草铵膦选择压条件下，获得了转RePAT*再生植株93株，其中阳性植株有8株，阳性率为8.6％。对转RePAT*基因植株T0和T1代植株抗性处理发现，部分植株可以在稀释100倍的18％草铵膦处理条件下存活。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 转基因作物发展和应用研究进展

1．2 抗除草剂转基因作物发展历程

1．2．1 抗除草剂转基因作物发展

1．2．2 抗广谱性除草剂

1．3 草甘膦及抗草甘膦转基因研究进展

1．3．2 草甘膦作用机理

1．3．3 抗草甘膦作物的获得途径

1．4 草铵膦及抗草铵膦转基因研究进展

1．4．1 草铵膦

1．4．2 草铵膦作用机理

1．4．3 抗草铵膦作物的获得

1．5 抗广谱性除草剂转基因油菜开发

1．6 抗广谱性除草剂基因和作物获得的新途径

1．7 本研究的目的意义

2．材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 载体和菌株

2．2 主要试剂和耗材

2．2．1 主要试剂

2．2．2 实验仪器

2．2．3 培养基和相关试剂的配制

2．3 实验方法

2．3．1 载体构建及电击法转化农杆菌GV3101

2．3．2 农杆菌介导的油菜下胚轴遗传转化

2．3．3 转基因植株的阳性检测

2．3．4 转基因阳性植株喷药处理

2．3．5 Southern blot

2．3．6 Western blot

2．3．7 插入位点鉴定

2．3．8 半定量RT-PCR反应

2．3．9 实验结果整理及数据分析

3．结果与分析

3．1 转化载体构建

3．2 I.variabilis-EPSPS*转基因油菜植株的培育与鉴定

3．2．2 油菜转I.variabilis-EPSPS*基因植株阳性鉴定

3．2．4 油菜转I.variabilis-EPSPS*基因植株转基因拷贝数分析

3．2．5 油菜转I.variabilis-EPSPS*基因阳性植株表达分析

3．2．6 油菜转I.variabilis-EPSPS*基因植株表达蛋白分析

3．2．7 油菜转I.variabilis-EPSPS*基因植株后代抗性表型鉴定比较

3．2．8 单拷贝转基因植株中的T-DNA插入侧翼序列鉴定

3．3 油菜转RePAT*基因植株的培育与鉴定

3．3．2 油菜转RePAT*基因植株阳性鉴定

3．3．3 油菜转RePAT*基因植株抗性鉴定

4．讨论

4．1 抗除草剂相关基因在油菜实际应用的若干思考

4．3 I.variabilis-EPSPS*作为转化标记可能性

4．4 外源基因整合类型和位点存在一定的偏好性

4．5 关于RePAT*基因转化效率低的可能原因

4．6 抗广谱性除草剂在油菜应用和种质资源中的展望

4．7 下一步工作设想

参考文献

致谢